wb灰度值测定.doc

ImageJ测到了WB条带灰度值关于用ImageJ量化westernblot条带灰度值,在网上一直盛传着两种操作方法,然鹅~小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法,甚至将灰度与光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机会学习下,请先看看你是用以下那种方法测量灰度值?以下是两种方法的具体操作。方法一:1、打开ImageJ软件→左上角file→Open选择自己的条带图片(事先把条带摆正)2、把图片转化成灰度图片:Image→type→8-bit3、第一个矩形工具→选上所有条带4、analyze→Gels→selectfirstlane→Gels→plotlanes(在这第四步也可以分开选取,如:框选第一个条带→analyze→Gels→selectfirstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→selectnextlane)5、选中直线工具,将开口波峰关闭6、选中魔棒工具(正数第七个),点击波峰,就得出所有area值。方法二1、打开ImageJ软件→左上角file→Open选择自己的条带图片(事先条带弄正)2、把图片转化成灰度图片:Image→type→8-bit3、扣除背景:Process→SubtractBackground→50pixels并勾选LightBackground5、设定参数:Analyze→setmeasurement→勾选Area、Meangrayvalue、Min&maxgrayvalue、Integrateddensity6、Analyze→setscale→unitoflength选项里改为pixels,确定6、图像分割。Edit→Invert→选中椭圆圈(手残党首选)/不规则圆圈(心灵手巧党义无反顾),手动圈上单个条带7、Analyze→Measurement即得到Intden,重复6、7步就得到所有Intden值小伙伴们,你们是哪种方法呢?首先先把结论说出来,其实两者得出的area和Intden严格来说都不是灰度值,前者是面积而后者是光密度值,但用来量化WB条带都是OK的。 ImageJ这个软件在将westernblot条带量化时存在两种参数:灰度与光密度(假,暂且这么称呼,原因下文再说),这两者在理解使用ImageJ量化WB条带十分重要,请务必仔细看以下几个概念。1、灰度(gray):是指图像中各种颜色的深浅程度,它以整数值表示,一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为0-255共256级,每一像素点对应的数值即灰度,灰度值越小物体颜色越深。有兴趣的小伙伴,可以随意用ImageJ打开一张图片,光标在图片上任意移动,得到的value值最小为0(纯黑),最大为255(纯白)。2、光密度(OD,真):也就是吸光度(A),光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg(Io/Ib),其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。明确这两个概念后,我们再来看为什么称ImageJ里的光密度是“假”,因为在图像分析中的光密度(假)是由灰度值再经计算得到的,它是一个相对值,但其算法与OD值的算法类似。只是它的入射光强度由Westernblot胶片上最亮区域的平均灰度值代替,而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。即:图像分析系统的光密度值=lg(WB胶片上最亮区域的平均