免疫电泳 心得讨论.doc

免疫电泳心得讨论本文介绍了火箭免疫电泳的基本原理和主要操作流程。实验原理火箭免疫电泳( rocket immunoelectrophoresis , RIEP )是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时,含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动,而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时,形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰,峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此,当琼脂中抗体浓度固定时,以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标,抗原浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量;反之,当琼脂中抗原浓度固定时,便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。主要试剂 1. , 巴比妥-- 巴比妥钠缓冲液巴比妥钠 g 巴比妥 g 硫柳汞 100 mg (防腐剂) 蒸馏水加热溶解并定容至 500ml 2. 1% 预复琼脂(或琼脂糖) 1g 琼脂(或琼脂糖)加蒸馏水 100ml 溶化即可。 3. % 琼脂糖凝胶 琼脂糖加 50ml 蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解(注意不要溢出且注意加入蒸发的水),然后再加入 50ml 上述巴比妥缓冲液混匀,置 4℃保存备用。主要设备 1. 玻璃板 2. 模具 3. 打孔器和挑针 4. 滴管 5. 有盖搪瓷盒(内铺有湿润的滤纸) 6. 温箱( 25℃) 7. 三角烧杯 8. 玻璃搅拌 9. 微量加样器 10. 其他常用器材实验材料抗原及相应免疫血清实验步骤 1. 抗原、抗体浓度的选择以分别固定抗原含量与抗体浓度的方法,选取最小抗原量与最低抗体浓度,在免疫电泳后能出现最清晰项端狭窄且尖的锥形沉淀峰, 长达 2~ 5cm 者为标准。一般抗原用量为 ~5 微克,抗血清用量为 5~ 10 微升,稀释度于 1: 10~ 1: 200 之间进行选择。 2. 预复琼脂玻板的制备将溶化的 1% 预复琼脂用滴管加玻板上,使之能将表面覆盖即可, 放于温箱内干燥(或自然干燥),即可用以制备凝胶板。 3. 抗血清琼脂板制备根据上述选择结果,取一定量抗血清与一定量融化并冷却至 56℃的 % 巴比妥缓冲琼脂混合,使抗血清的浓度为以上述方法选择出的最适浓度,浇制抗血清琼脂板。琼脂厚度为 1~ 2mm ,玻板大小可根据实验所需而确定。如用 5× 大小玻板时,约需抗血清琼脂 6ml. 4. 打孔、加样待琼脂凝固后,于距玻板一长边 10mm 处,以 3mm 孔径打孔器打孔一排,孔距 5mm. 于各孔中加入抗原液,每孔 10 微升。每次实验中应加入几个不同浓度的标准抗原以作对照。稀释范围包括标本含量的最高与最低水平。 5. 电泳将琼脂板置于电泳槽横梁上,加样端位于负极,以双层滤纸联接琼脂板与电泳槽内缓冲液(槽内缓冲液为 巴比妥缓冲液)。接通电源,板端电压 3v/cm ,电流强度 3mA/cm ,电泳 5小时。 6. 结果判定电泳毕,取出琼脂板,依次用生理盐水、蒸馏水浸泡后,加 1% 鞣酸冲洗琼脂板,晾干,即可观察与测定结果。也可以常规蛋白质染色法染色后观测结果。测定结果的方法有两种:一是测量沉淀峰的高度(自孔中央至峰尖),以 mm 计;另一是以求积仪测量沉淀峰的面