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蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein Structure and Function of Protein ( 四) 第四节蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质二、蛋白质分离和纯化三、多肽链中氨基酸顺序分析——蛋白质一级结构的测定(一)两性解离和等电点及其分离纯化 Pr是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的 pH值。 Pr COOH NH 3+ Pr COO - NH 3+ Pr COO - NH 2 OH -H + OH -H + pH= pI pH< pI pH> pI pI定义: 在某一 pH值溶液中, Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当 Pr分子所带正负电荷相等,净电荷为零此时溶液的 pH值称为 Pr的pI。 Pr分子颗粒大小 1-100nm 之间,属胶体颗粒范围, 在溶液中能形成稳定的胶体。原因: (二)蛋白质的胶体性质表面形成水化层表面同种电荷的斥力除去这两个因素除去这两个因素,Pr ,Pr 就会发生沉淀。由于就会发生沉淀。由于胶体胶体溶液中的溶液中的 Pr Pr不能通过半透膜, 不能通过半透膜, 因此可以应用因此可以应用透析透析法法将非蛋白的小分子杂质除去。将非蛋白的小分子杂质除去。( (三)蛋白质的变性、沉淀和凝固吴宪教授吴宪教授 1931 1931 年年: :““天然天然 Pr Pr 分子借助次级键连分子借助次级键连接而成一种紧密,有规则的空间结构,变接而成一种紧密,有规则的空间结构,变性作用使次级键破坏从而使结构松散性作用使次级键破坏从而使结构松散””。。 1. 蛋白质的变性(denaturation ) 定义:在某些理化因素的作用下, Pr严格的空间结构被破坏(不包括肽键的断裂),从而引起若干理化性质和生物学性质改变的现象。变性后的蛋白质称变性后的蛋白质称变性蛋白变性蛋白, , 能使能使 Pr Pr变性变性的物质叫的物质叫 Pr Pr变性剂变性剂。。变性因素物理因素高温、高压紫外线、 X射线、电离辐射和超声波等化学因素强酸、强碱有机溶剂、重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等变性实质: 破坏了空间结构,一级结构不受影响(分子组成、 MW不变)。变性蛋白质的特点旋光性、光吸收改变等; ①生物学活性丧失②理化性质改变③易被蛋白酶水解溶解度↓,沉降率↑, 粘度↑, 扩散速度↓, 酶水解。变性与复性变性与复性变性可逆变性: Pr 变性后如将变性剂除去,该 Pr 分子的天然构象和生物学活性还能恢复。不可逆变性:若变性条件强烈,作用时间长,构像变化大,理化性质难以恢复。举例:医疗;生物制品保存;生活等。 RNase RNase 的变性与复性的变性与复性变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀, 变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀, 但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为白质变性并凝聚成块状称为凝固凝固。因此,凡凝固的蛋白。因此,凡凝固的蛋白质一定发生变性。质一定发生变性。总结: 总结: Pr Pr变性、沉淀与凝固之间的关系变性、沉淀与凝固之间的关系变性变性 Pr Pr不一定沉淀不一定沉淀沉淀沉淀 Pr Pr不一定变性不一定变性变性变性 Pr Pr不一定凝固不一定凝固凝固的凝固的 Pr Pr一定变性一定变性 2. 2. 沉淀与凝固沉淀与凝固定义: 定义: 蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为的现象称为沉淀沉淀。。++ +++ +++--- --- -- ++ +++ +++--- --- -- 蛋白质胶体颗粒的沉淀蛋白质胶体颗粒的沉淀带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒(沉淀) 带正电荷的蛋白质(疏水胶体) 带负电荷的蛋白质(疏水胶体) 碱酸(亲水胶体) (亲水胶体) (亲水胶体)