开题报告丁小红毕业设计(论文)开题报告.doc

杭州师大学本科生毕业设计(论文)开题报告题目Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/Isl2基因表达模型的标签小鼠的基因型鉴定学院生命与环境科学学院专业班级生技142学生丁小红学号2014214138指导教师盛东来职称讲师一、选题背景与意义(说明所选课题的历史背景、国外研究现状和发展趋势) 小鼠作为哺乳动物遗传研究中首选的模式生物。经过过去几十年的努力,培育基因打靶和转基因小鼠已经变成很平常的工作,以目前的技术可以获得在核酸水平上的突变品系。现在,诸如此种基因组修饰变得越来越精细,而在基因水平上标记不同的细胞群已成为非常普遍的研究。 LacZ,即细菌β-半乳糖苷酶基因在许多小鼠研究中作为筛选标记,它是由4个亚基组成的四聚体,-gal比较稳定,用X-Gal为底物进行染色时,呈蓝色,,比如常用于转化菌株筛选,β-半乳糖苷酶显色反应选择法,即,,基因克隆中常用的质粒载体PUC19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。 GFP,即绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein)其自身的特点,它能够在体或体外进行实时监测。GFP还有另一个优势,能采用流式细胞仪、共聚焦显微镜及荧光计等技术进行定量检测。目前,人们已经改进了野生型GFP基因,从中获得的几种变体在热稳定性和荧光强度等方面都有所增强。增强型GFP(EGFP)就是其中之一。现在,它已普遍应用于转基因或基因打靶小鼠。更为重要的是,人们现在已经开发出多种GFP光谱变体,其中两种全新颜色的变体——增强型黄色荧光蛋白(EYFP)和增强型蓝绿色荧光蛋白(enhancedcyanfluorescentprotein,ECFP)已应用于小鼠研究中。 由于ECFP和EYFP的谱线轮廓截然不同且没有重叠,所以这两种荧光蛋白可同时用作报告基因并共同显色,这对体双标记或荧光能量转移分析等研究是非常理想的。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的应用为科学研究提供了一个空前的高精度检测方法,代表着小鼠基因组改造技术的未来发展方向,并开启了在同一个动物体应用组合无创性报告基因的广阔前景。 因此本文将通过Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/Isl2基因表达模型的标签小鼠的基因型鉴定。二、研究的基本容和拟解决的主要问题 研究基本容: 小鼠解剖、DNA采集与提取、引物设计、基因片段PCR,琼脂糖凝胶电泳 拟解决的主要问题: 作为导师研究课题的一部分,完成基因型鉴定后为后续实验奠定基础。三、研究方法及措施(拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等) 1、小鼠解剖: (1)准备实验工具(PBS缓冲液、培养皿、解剖工具等); (2)捏住母鼠尾部将母鼠提起,置于鼠笼上,用颈椎脱臼法处死; (3)用75%酒精喷壶喷湿母鼠腹部皮毛,在培养皿中倒入PBS缓冲液; (4)用镊子提起母鼠腹部皮肤,用剪刀横向剪一个创口,撕开; (5)用剪刀剪开腹腔膜,用镊子取出子宫,移至培养皿中; (6)在体视显微镜下操作,用镊子撕开子宫及羊膜,分离胚胎; (7)将胚胎移至干净PBS缓冲液中,剪尾做DNA提取; 2、DNA采集与提取: DNA采集 (1); (2)解剖小鼠取视网膜、耳、血液、心肌、皮肤等组织部分置EP管备用。 DNA提取 方法一:碱裂解法 (1) (2)加入100ul50MNaOH (10mlstockof50mMNaOH=+50ul10NNaOH) (3)95℃加热10分钟,涡旋 (4)加入10ul1MTris(PH=),涡旋 (5)12000g离心5分钟 (6)加入100ulTE(PH=) 方法二:蛋白酶消化 (1) (2)加入400ulTaildigestionbuffer及2-5ul10mg/mlproteinaseK (3)60℃加热,过夜 (4)加入200μl酚氯仿异丙醇溶液,涡旋至乳白色,14000g离心5分钟 (5)吸取300ul上清液至新EP管,加入900ul100%乙醇,摇动4-6次, 14000g离心1分钟 (6)倒去上清液,加入350ul75%乙醇,14000g离心1分钟 (7)倒去上清液,自然风干 (8)加入50ulTE(PH=) 蛋白酶k是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,是枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,从林伯氏白色念球菌(tritirachiumalbumlimber)中纯化得到,用于生物样品中蛋白质的一般降解。 3、引物设计: 本次实验所用引物由美国罗切斯特大学甘霖教授完成。 4、基因片段PCR: