链霉菌实验操作手册.doc

链霉菌实验室操作手册第一章培养基抗生素生长因子 3常用抗生素及其使用浓度 3LB(Luria-Bertani)培养基 3LA 3基本培养基(MM) 3R5(1L)链霉菌原生质体转化时用 4YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L(液体培养链霉菌) 4TSBY(1L)(液体培养链霉菌) 4MS培养基 52CMY培养基(用于井岗的接合转移) 5YMS培养基(阿维,井岗产孢) 5YD培养基 5生长因子补充物的使用浓度 5第二章DNA基本操作 7大肠杆菌质粒的抽提 7酶连反应 7DNA片段凝胶回收 7DNA纯化 9链霉菌质粒DNA的小量提取(还需改进) 10去磷酸化处理(详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明) 10AT克隆(详见说明书) 10SouthernBlot 11第三章PCR及相关技术 13PCR 13PCR重组(详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术) 14PCR定点诱变(DpnI法) 14第四章基因片段转移技术 15大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 15DNA转化 15大肠杆菌质粒的快速检测 15接合转移(详见英文《手册》249页) 16链霉菌原生质体的制备 16链霉菌原生质体的转化 17PCR- 17第五章RNA操作技术 19链霉菌总RNA的抽提 19链霉菌的RT-PCR(promegaRTkit) 19第六章蛋白质基本操作技术 21SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色 21大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提(用于由IPTG诱导的表达体系): 21链霉菌总蛋白抽提: 22大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测(含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系): 22WesternBlot 23第七章遗传作图相关技术 25链霉菌孢子悬液的制备 25链霉菌中NF的证明 25孢子杂交 25在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 25第八章其他技术 27链霉菌菌种保藏 27检测链霉菌淀粉酶的活性 27第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度(μg/ml)链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin,AmpChloramphenicol,CmlHygromycin,HygKanamycin,KmSpectinomycin,SpcStreptomycin,StrThiostrepton,ThioErythomycin,EryApramycin,Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R-2550502510-50R---50--5050-1002550505025不敏感2030-50*–表示无记录或不能使用,贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考!!!*R表示不敏感*Km和Am有交叉抗性,所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量,并作好对照。*Hyg易见光分解,应用锡箔纸包好。*有些抗生素需要在低盐的环境(如DNA培养基)下筛选效率较高,如Hyg,Km,VioLB(Luria-Bertani)培养基胰蛋白胨10g,酵母抽提物5g,NaCl5g,葡萄糖1g,蒸馏水加至1000ml,(灭菌后第一次用时还要调一次)-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同,%,而华美的需要2%)。*做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基(MM)溶液:L-,,MgSO4·,FeSO4·,,灭菌,使用时每瓶加入50%葡萄糖(8磅灭菌)5ml,。配置MM的琼脂有labagar、Iceagar(IA)R5(1L)·,倒入250ml上述溶液,然后塞上塞子后8磅灭菌(114度15分种)。使用时,将培养基融化,每瓶中加入:KH2PO4(%)·2H2O(5M)1mlL-脯氨酸(20%)(1M)