超氧化物歧化酶(sod)活力测定资料.doc

超氧化物歧化酶( SOD )活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或衰老过程中,细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O 2 .-)、羟自由基(OH .)、过氧自由基(ROD )、烷氧自由基(RO)等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统,超氧化物歧化酶( SOD )、过氧化氢酶( CAT )、过氧化物酶( POD )和抗坏血酸过氧化物酶( ASA-POD )等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸( V C)、 V E和还原型谷胱甘肽( GSH ) 等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。 SOD 、CAT 等活性氧清除剂的含量水平和O 2 .-、H 2O 2、OH .和O 2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。自1968 年发现 SOD 后,立刻引起科学界的高度重视,近40年来这方面的研究进展非常迅速,它的应用领域日益拓宽, SOD 也有了产品。二十世纪 80年代后期,我国关于 SOD 的研究及应用也形成了热点,如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。超氧自由基(O 2 .-)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子,化学性质非常活泼,是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时,机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶( Superoxide Dismutase ),简称 SOD ,能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基( O 2 .-),生成 H 2O 2和O 2。H 2O 2由过氧化氢酶( CAT )催化生成 H 2O和O 2,从而减少自由基对有机体的毒害。一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝(NBT )光化还原法测定 SOD 活力的方法和原理, 并了解 SOD 的作用特性。二、原理 SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD :Mn-SOD - SOD ,它们都催化下列反应: 由于超氧自由基( O 2 .-)为不稳定自由基,寿命极短,测定 SOD 活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定 SOD 的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子 O 2 .-,当加入 NBT 后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲月替(黄色),继而还原生成二甲月替,它是一种蓝色物质,在 560nm 波长下有最大吸收。当加入 SOD 时,可以使超氧自由基与 H +结合生成 H 2O 2和O 2,从而抑制了 NBT 光还原的进行,使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的 SOD 酶液,光照一定时间后测定 560nm 波长下各液光密度值,抑制 NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比,以酶液加入量为横坐标,以抑制NBT 光还原相对百分率为纵坐标,在坐标纸上绘制出二者相关曲线,根据 SOD 抑制 NBT 光还原相对百分率计算酶活性。找出 SOD 抑制 NBT 光还原相对百分率为 50%时的酶量