渗透休克法提取重组青霉素G酰化酶及酶学性质研究.pdf

第卷第期福建师范大学学报自然科学版. ,
年月.
文章编号:——
渗透休克法提取重组青霉素酰化酶及酶学性质研究
蒋咏梅。,章文贤,魏东芝。
.福建师范大学生命科学学院,福建福州;
.鲁华生物技术研究所,华东理工大学,上海
摘要:为简化后期提取工艺,采用渗透休克法提取基因菌重组青霉素酰化酶,回收率.% 的酶
蛋白释放到胞外,纯度达% ,比酶活./. 酶学性质研究表明, 的最适作用和温度分
别为~ 和℃,在.~ .和低于℃的范围较稳定.
关键词:青霉素酰化酶;渗透休克;酶学性质
中图分类号:. 文献标识码:


—~, —, —
.,,,;
. ,
,,
:,—
.. .
,% ./,.
℃~ ,
℃.~ ..
: ;;
青霉素酰化酶,,.....,也叫青霉素酰胺水解酶—
或青霉素酰胺酶,自年在产黄青霉
中发现以来,就以良好的催化酰化/
业的应用外, 还因其具有良好的底物专一性和对映体的选择性,用于光学异构体的合成和拆分.
鉴于青霉素酰化酶的广泛用途,
是大肠杆菌产生的胞内青霉素酰化酶,常规采用机械破碎结合多次层析的分离方法,不仅费时费力,
得到的纯度也较低. 金属离子亲和层析虽可提高酶的分离效率,,
采用离子交换和双水相分离法得到了较好的纯化效果,但步骤相对繁琐.
采用渗透休克法选择性地分离目标蛋白,
来,人们尝试采用该方法释放各种胞内酶,但由于得到的酶蛋白纯度不高,因此,缺少系统的研究.
由于大肠杆菌产生的青霉素酰化酶定位于仅含总蛋白/~%蛋白质的周质空间内,采用渗透休
克法提取,无需特殊设备和昂贵药品,,对青霉素酰化酶的纯度要
收稿日期:——
基金项目:上海市重点学科建设项目
通讯作者:蒋咏梅一,副教授,...
第期蒋咏梅等:渗透休克法提取重组青霉素酰化酶及酶学性质研究
,本文尝试采用渗透休克的方法对大肠杆菌产生的重组青霉素酰化酶进行一步纯
化,优化了其操作条件,并对的酶学性质进行了研究.
材料与方法
. 实验材料
.. 菌种
大肠杆菌,.
.. 主要试剂
对二甲基胺基苯甲醛—,简称溶液,溶于
无水甲醇;青霉素,华北制药厂出品;其余均为市售分析纯试剂.
.. 培养基
保藏培养基:培养基,含/卡那霉素.
发酵培养基:酵母粉./,甘油./,./,卡那霉素,微量元素适量.
调至..
. 实验方法
.. 培养条件
三角瓶装发酵培养基,接种量,。,/,旋转摇床培养,后加
./诱导,继续培养后收集菌体.
.. 超声波破碎细胞
离心收集菌体,/—,菌体重悬,超声破碎
工作间歇,保持菌液始终处于低温℃.破碎后在/下冷冻离心,所
得上清液即为粗酶液.
.. 渗透休克
发酵液离心去上清液,菌体洗涤后重悬于同体积高渗液中,室温放置一定时间,。离心,
取离心后的菌体迅速悬浮于预冷的同体积的/.中,冰浴.