流式细胞术快速检测念珠菌对唑类药物敏感性氟康唑作用机制研究.pdf

温州医学院硕士学位论文流式细胞术快速检测念珠菌对唑类药物敏感性及氟康唑作用机制的研究姓名:胡庆丰申请学位级别:硕士专业:临床检验诊断学指导教师:周永列 201105 温州医学院硕士学位论文流式细胞术快速检测念珠菌对唑类药物敏感性及氟康唑作用机制的研究目的:建立流式细胞术快速检测念珠菌对唑类药物敏感性试验(FCST)的方法, 并用CLSI的参考方法进行方法学的评价。观察氟康唑对念珠菌作用后,检测真菌细胞的活性氧、线粒体膜电位变化和细胞周期变化,初步探讨氟康唑在诱导凋亡发生中的作用。方法:以非膜透性染料碘化丙锭(PI)进行染色,使用未处理的活菌和乙醇处理的死菌在FL3通道,通过调整电压在SS/log(FL3)图上进行阀门的设置把真菌细胞分成清晰的两群。用流式细胞术检测标准菌株在不同染色条件、菌液浓度、孵育时间等条件下进行药敏试验,寻找最适宜的实验条件。用本实验室优化的实验方案和CLSI M27一A2微量稀释法对标准菌株进行双份平行药敏测定,经比对得出FCST的折点判断方案,从而建立流式细胞药敏试验(FCST)方法。用此方法和CLSI M27一A2 微量稀释法双份平行检测30株临床分离白色念珠菌的药敏结果,评价FCST方法和M27-A2的符合性和重复性。应用建立的FCST方案和M27-A2方法检测氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑对136株临床分离的念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌)的药敏结果,通过MIC分布情况、MIC符合率、耐药符合率等方面进行对比,来评估FCST方案的方法学。检测氟康唑敏感性不同的临床菌株(白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌)在不同浓度的氟康哗共同培养后,用流式细胞术来分析检测凋亡相关的参数: 荧光探针双氢罗丹明(DHR)标记ROS、荧光探针四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(Jc—1)标记线粒体△tpm的变化和DNA—Prep试剂盒标记细胞周期。应用抗氧化物质谷胱苷肽和氟康唑与氟康唑敏感的热带念珠菌共同培养检测ROS和细胞周期的变化,观察抗氧化物质抑制凋亡发生变化。结果:经过调整电压后通过阈门的设置,把活菌与死菌在SS/log(FL3)图上分为两群分界清晰的细胞,对不同比例死菌与活菌混合液检测值与设定值具有良好的相关性(r=)。经过不同条件测试后,×108 CFU/ml,孵育时间为 3小时,在培养物离心后,取沉淀物加入200 u PI和20 ul去氧胆酸钠染色5-10 温州医学院硕士学位论文分钟时可得到良好的实验结果。MIC折点判断标准为死菌比率在连续系列管中高浓度管比低浓度管出现一倍以上的增长,并且保持稳定或连续增长,则可判定高浓度管药物浓度为该菌的MIC值。临床菌株验证发现,本法有很好的重复性,优于M27一A2方案,MIC结果与M27-A2微量法比较,%,相关性很好(r=),差异无显著性(P:)。 FCST法和CLSIM27-A2微量稀释法同时进行检测四种药物的MIC范围一致,但是M27一A2法测定的MIC50和MIC90均高于FCST法。四种药物的MIC符合率发现氟康唑和酮康唑两种方法的符合率较高,而伊曲康唑两种方案的符合率稍差,为 %。从耐药符合率来看,除伏立康唑外的三种药物均符合率均在90%以上,总体来i兑,流式细胞术在唑类药物的抗真菌药敏结果与M27一A2符合率较好。三种氟康唑耐药的念珠菌,在氟康唑作用后,细胞周期、ROS和线粒体△tgm 均没有明显变化;而氟康唑敏感株的ROS水平随氟康唑的浓度增加而升高,有一定的剂量依赖关系;细胞周期进程明显受影响,大部分念珠菌阻滞在G2/M期,呈一定的剂量效应关系,并出现SubGl凋亡峰。白色念珠菌和热带念珠菌的线粒体△Wm随氟康唑的浓度增加而降低,光滑念珠菌的线粒体△1l,m随氟康哗的浓度增加而升高。谷胱苷肽在低浓度氟康唑时可以较好的清除ROS,但随着氟康唑浓度的升高,谷胱苷肽清除ROS能力有所下降。G2/~8 ug/ml时明显降低,但在高浓度氟康哗时G2/M期变化不大,但是凋亡峰的数量明显降低。结论:本研究建立的FCST具有快速、重复性好、易于判断MIC值、准确性高等优点, 在临床抗真菌药物敏感性检测中具有很大的应用fj{『景。氟康哗作用于念珠菌时, 抑制细胞氧化酶和过氧化酶的活性,导致ROS的过量产生,进而促使线粒体膜电位改变,引发级联反应引起细胞凋亡,这可能是氟康唑诱导念珠菌发生凋亡的重要机制。关键词: 流式细胞术;念珠菌属;唑类药物;最小抑菌浓度;活性氧:线粒体膜电位; 细胞周期;细胞凋亡温州医学院硕士学位论文 AStudy on the Method ofRapidly Detect ing Susceptibility