基因定位常用方法.ppt

第四节基因定位常用的方法
● Wiison于1911年将红绿色盲基因首次定位于X
染色体上,
年, Donahue利用系谱分析的方法将 Duffy血型基因
定位于1号染色体上,是人类首次在常染色体上进
,体细胞杂交重组
DNA、分子杂交和PQR等技术的出现和应用,基因
定位的方法愈加先进,基因定位的速度、数量明
显加快。人类基因组计划的实施和完成,更加促
进了基因定位的进程
基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的
认识有重要意义。
明确几个基本概念
基因:DNA的功能片段。
基因组:有机体全部DNA序列(它包括基因
外的非基因DNA序列),它是基因和
非基因DNA序列的总和。
基因定位:是用一定的方法将基因确定到染
色体的实际位置
遗传做图:是以研究家族的减数分裂,以了解两
个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离,
它表明基因之间连锁关系和相对距离,并以重组
率来计算和表示,以厘摩(cM)为单位。
染色体定位:只把基因定位到某条染色体上。
细胞水平上的基因图又称细胸遗传图
●区域定位;从细胞遗传学水平,用染色体显带等
技术在光学显微镜下观察,将基因定位到染色体
的具体区带。
基因定位的方法
1、体细胞杂交法基因定位
体细脑:即生物体除生殖细胞外的任一细
胞。
1)体细胞杂交的概念:
也称细胞融合( ce infusion),是
将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。
新产生的细胞称杂种细胞( hybr id ceI),
含双亲不同的染色体。
2)对象:{人的细胞
鼠类:大鼠、小鼠、仓鼠
3)杂种细胞的特点:
在繁殖传代过程中,人的染色体优先
丢失,以至最后只剩几条或一条人的染色
体,而啮齿类的染色体被保留下来
4)原理:
细胞进行融合时,培养液中只有部分细
胞融合成杂种细胞,还有大量未融合的双
亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。
为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而
亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细
胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的
差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择
系统。
HAT选择系统:
人的突变细胞株:缺乏 HGPRT酶
小鼠细胞株:缺乏TK酶
两者融合培养于HT培养基中
HAT培养基
H为次黄嘌呤,是 HGPRT的底物,为DNA合成提
供原料(核苷酸旁路合成原料)
A可阻断正常的DNA合成(嘌呤及TM合成受抑
制)
T在胸苷激酶
的作用下生成胸腺嘧啶核
苷酸,为DNA合成提供原料
因此在HT培养基上
人细胞:
①由于A的存在,正常的DNA合成通路受
阻
②同时由于 HGPRTI的缺乏,无法利用次黄
嘌呤通过旁路合成DNA(嘌呤合成障碍)
●鼠细胞:由于A的存在正常的DNA合成通
道受阻,有 HGPRT可以利用次黄嘌呤合成
腺嘌呤,鸟嘌呤,但由于无TK,无法合
成胸腺嘧啶。(嘧啶合成障碍)
杂翀细胞:有 HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟
嘌呤;并可以利用ⅨK合成胸腺嘧啶(
呤和嘧啶都可以正常合成)
将筛选出来的杂种细胞转移到正常培
养基继续培养,由于人和鼠都有各自不同
的生化和免疫学特性, Miller等运用体细
胞杂交并结合杂种细胞的特征,证明杂种
细胞的存活需要胸苷激酶(TK)。凡是含
有人17号染色体的杂种细胞都因有K活性
而存活,反之则死亡,从而推断TK基因定
位于17号染色体上,这是首例应用体细胞
杂交法进行的基因定位。