吲哚乙酸氧化酶活性测定.doc.doc

吲哚乙酸氧化酶活性的测定一、原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下, 被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小, 对调节体内吲哚乙酸的水平, 起着重要的作用, 而影响植物的生长。酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。二、仪器及药品 T6 新悦型分光光度计离心机恒温水浴锅天平研钵试管移液管烧杯 20mmol/L 磷酸缓冲液, (见附表 2)。 1mmol/L2 ,4—二氯酚:称取二氯酚 用蒸馏水配制成 100ml 。 1mmol/L 氯化锰:称取 MnCl 2· 4H 2O 用蒸馏水配制成 100ml 。 1mmol/L 吲哚乙酸: 称取 IAA 用少量乙醇溶解, 然后将其倒于盛有约 90ml 蒸馏水的容量瓶中(100ml) ,稀释至刻度。吲哚乙酸试剂 A或B (任备其中之一): 试剂 A: 15ml FeCl3 , 300ml 浓硫酸( 比重为 ), 500ml 蒸馏水, 使用前混合之即成,避光保存。用时 1ml 样品中加入试剂 4ml 。试剂 B: 10ml FeCl3,500ml 35% 过氯酸,使用前混合之即成,避光保存。用时于样品中加入试剂。试剂 B 较试剂 A 灵敏。三、操作步骤 1 .将大豆或绿豆种子于 30℃温箱中萌发 3梍4 天,选取生长一致的幼苗,除去子叶, 留下胚轴作材料。 2 .取 下胚轴,置研钵中,加入预冷的磷酸缓冲液 5ml ,置冰浴中研磨成匀浆。再按 100mg 鲜重材料加 ml 磷酸缓冲液的比例, 用磷酸缓冲液洗涤研钵。离心( 4000r/min ) 10 分钟,所得上清液即为粗酶液。 3 .取试管 2 支,于一试管中加入氯化锰 1ml ,二氯酚 1ml , IAA2ml ,酶液 1ml ,磷酸缓冲液 5ml , 混合均匀。另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外, 其余成分相同。一起置于 30℃恒温水浴中,保温 30 分