实验碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt

实验五 碱性磷酸酶米氏常数的测定
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一、目的要求

（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
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二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法
（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
1．原理
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2．主要方法：
（1）比较吸收光谱曲线
（2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。

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（3）比较吸光度的比值

纯DNA
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（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
1．原理
Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0
A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL
其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；
K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
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2．常用方法
（1）标准曲线法
OD或Ａ
　　　　　　　　　　　　　　　　　浓度
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
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（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。
（3）摩尔吸光系数法
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
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(三)米氏常数的测定原理
酶促反应v-[S]曲线
v

[S]
推导出米氏方程为：
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数
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米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
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