氨苄青霉素抗性基因.ppt

第六章重组体克隆的筛选和鉴定
第一节载体表型选择法
匚、抗药性标记及其插入失活选择法
:
pBR32质粒上有两个抗菌素抗性基因:
Te和Ampr
Te上有插入位点 Bamhi和SaI1;
Amp上有插入位点PstI
BR322
Nru
PBR322
BspMI
(4368 bases)
3
2pBR3抗菌素标记选择
(1)四环素:
抑制细菌生长,但不杀死细菌。
(2)氨苄青霉素抗性基因:
生β-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为
青霉酮酸,使碘-青霉素指示液(I2KI-
Ampicillin)(蓝灰色)褪色。
(3)环丝氨酸:
杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。

(1)四环素抗性插入失活
如果在Ter上插入外源DNA,导致四
环素抗性基因失活,可用四环素加环
丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Ter失活的菌生长被四环素抑制,不被环
丝氨酸杀死,保留下来
Tet不失活的菌抗四环素,能分裂生长,
反而被环丝氨酸杀死。
四环素+环丝氨酸培养基
pBR322
氨苄青霉
素培养基
外源DNA插入
四环素抗性基因
无环丝氨酸培养基
(2)氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Amp上插入外源DNA,导致氨苄
青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素
指示液选择
四环素培养基
pBR322
八
加入碘-青霉素
指示液
外源DNA插入氨苄
青霉素抗性基因
挑选兰色克隆
仨、β半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
半乳糖+葡萄糖
β-半乳糖苷酶
gal
半乳糖+5-溴4氯靛蓝
深蓝色
:
载体上有一段β半乳糖苷酶基因(Lacz)的a片段
(氨基端),其上有外源DNA的插入位点。受体菌
基因组中有突变的β半乳糖苷酶基因(a片段缺
失)。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组
可以互补形成完整有功能的β半乳糖苷酶。

Lac
含Amp、Xgal
Lacz
IPTG的培养基
载体B半乳糖苷酶基因挑选白色克隆
的a片段中插入外源DNA
假阳性:
如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有
中止密码;(不破坏α肽)