2021年总蛋白提取试剂盒新版说明书.doc

总蛋白提取试剂盒 (Total Protein Extraction Kit)
P1250：蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提, 100 extractions)
描述：从组织细胞中提取总蛋白是Western Blot关键步骤。实体软组织如脑脊髓富含磷脂，神经血管含大量结缔组织，而脂肪则有大量油脂，常规方法难以有用从这些组织提取蛋白。本试剂盒为组织或培养细胞总蛋白提取提供完整处置方案。用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织，或直接用裂解-结合缓冲液重悬培养细胞，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥后即可得到总蛋白。蛋白沉淀溶解后用常规方法进行蛋白定量。提取过程可在30-60分钟内完成，，极为简便高效。通常一次提取10-100mg组织所获取总蛋白可进行几十到上百次分析如蛋白质电泳、Western Blot、免疫共沉淀。
组成 1. 裂解-结合缓冲液 100 ml 2. 抽提试剂 100 ml
每毫升裂解缓冲液和抽提试剂可提取10-100mg组织或1 ´ 107细胞。试剂盒裂解缓冲液是过量。
适用 多种实体软组织(> 1 mg)，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道组织、肾脏、
心脏、肌肉、血管、结缔组织等，和多种原代细胞和永生化细胞系。
保留：室温或4ºC保留2年
固体组织蛋白提取
每10--1 ml裂解液，放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量组织，否则形成蛋白膜厚、致密且难溶。少量小未破碎组织不影响后续抽提。
，弃去剩余组织匀浆液。(1 ml)抽提试剂充足混匀。室温或4ºC静置10分钟，偶然晃动。注意：(1)如组织量<10mg，在下一步离心时形成蛋白膜易碎，静置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪组织时应4ºC静置40min以上以充足去除油脂。(3) Blot。(1 ml)抽提试剂是成功关键。
10,000g 4ºC离心10分钟，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)假如不能分相，可再加入50ml蒸馏水混匀离心。 (3)假如初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入1ml纯乙醇混匀，10,000g 4ºC离心3分钟。弃全部液体，蛋白沉淀在管底。
敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。
每100mg组织所得到蛋白加 200-1000ml用户自备缓冲液，95ºC煮10分钟。室温放置20~60分钟溶解沉淀。参见后面说明。
培养细胞蛋白提取
参见固体组织蛋白提取程序中斜体字注解
消化洗涤并800 g离心收集细胞。每5-10 x ml裂解液，振荡重悬，4ºC净置2分钟。