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河北农业大学
硕士学位论文
植酸酶基因定点突变的研究
姓名:卢海强
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:贾英民;郭润芳
2009-06-12
摘要
定点诱变(site directed mutagenesis,SDM)技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领
域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子,进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能
之间的关系。定点诱变技术可以分为PCR介导的和非PCR介导的,由于近年来PCR的迅速发展,
其PCR介导的定点突变方法应用也越来越广泛,尤其是其中的大引物定点突变方法由于其自身的
优点在定点突变方法中具非常重要的地位。但其大引物方法本身也存在一些不足:胶分离纯化大
引物过程费时费事,并且全长扩增产物的产率均较低。本试验对传统的大引物突变方法进行了改
进,通过采用不对称扩增来消除其多余引物和加入酶DpnI消除野生模版对突变效率的影响并且省
去了过程中的凝胶纯化,简化了步骤,节省了时间,其突变效率达到85%。此种方法在应用于植
酸酶的定点突变的研究中时,取得了很好的突变效果。
植酸酶是催化植酸及其盐类水解成低磷酸化的肌醇和磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。在
饲料中添加植酸酶不但可以提高动物对磷的吸收,降低环境中磷的污染,而且能解除植酸对金属
离子、氨基酸的螯合作用,大大提高饲料的利用效率,在国内外饲料工业中有着广泛的应用前景。
由于黑曲霉来源地植酸酶的最适 pH 值为 ,而单胃动物肠道中的 pH 为 左右,因此本试验
想通过定点突变方法使其适应肠道中的低 pH 环境,使其更好的应用于生产。本试验采取改进的
大引物方法,对 Q278,K281 两点进行突变并将突变的基因转入到真核宿主中进行表达。通过与
酵母工程菌 GA-22 的所产植酸酶酶学性质的对比分析,GA-22 在 和 处各有一个酶活
峰,突变菌株 EE-1(K281E)的酶活为 81696U/mL,提高了酶活的 20%,最适 pH 值为 ,仅
有一个酶活峰。突变菌株 EE-2 (K281EQ278L)的酶活力为 62376U/mL,最适 pH 值为 ,仅有一
个酶活峰,在对其热稳定性的研究中时发现在 60℃和 80℃处理 30min 后的突变菌株 EE-1 的相对
残余酶活分别为 %,%,在 60℃和 80℃处理 30min 后的突变菌株 EE-2 的残余相对酶活
力为 %,%,而 GA-22 经过相同处理后的相对残余酶活分别为 %,%,得知对双
点进行突变时高了工程菌 GA-22 的热稳定性。

关键词:定点突变;植酸酶;单链产物;PCR
Research of site-directed mutagenesis of phytase gene

Author: LU Hai-qiang
Supervisor: JIA Ying-min
GUO Run-fang
Major: Microbiology

Abstract
Site-directed mutagenesis (site directed mutagenesis, SDM) technology is abio-engineering
research in recent years in an area of rapid development. Through site-directedmutagenesis
can transform the purpose of in vitro DNA molecules, thus the study of gene expression
and protein structure and function relationship. Site-directed mutagenesis techniques can
be divided into PCR-mediated and non-PCR-mediated, as in recent years the rapid
development of PCR, the-mediated site-directed mutagenesis method is also more and
more widely applied, in particular the large primer site-directed mutagenesis method
method has a decisive position.