分子生物学实验报告.doc

分子生物学实验报告

题 目:围绕Southern杂交的系列分子实验
院(系): 创新实验学院
专业年级: 2013级生物技术基地班
姓 名: 姚国财
学 号: 2013015417
指导教师: 潘君风
2015年7月9日
目录
摘 要 5
5
5
实验材料 5
试剂 5
5
RT-PCR扩增目的基因cDNA 6
小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析 6
质粒DNA提取 6
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7
质粒载体和外源DNA的连接反应 7
7
7
实验器材 8
8
RT-PCR扩增目的基因cDNA 8
小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析 9
质粒DNA提取 9
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 9
质粒载体和外源DNA的连接反应 9
9
9
实验步骤 10
10
分析讨论 13
14
15
录 16
围绕Southern杂交的系列分子实验
作者：姚国财 指导老师：潘君风
摘 要：Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝酸纤维素膜上，经预杂交的封闭作用，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。地高辛标记的Southern杂交实验是本次分子生物学实验的核心环节，贯穿整个分子实验。实验报告将从获取不同的目的基因（小麦cDNA，小麦全基因组，小麦PCR基因组，小麦全基因组酶切产物，大肠杆菌质粒及其质粒PCR，质粒酶切产物等），凝胶电泳分离DNA转移到NC膜上，与标记的DNA探针杂交这三个方面将本次分子实验整理汇总成本篇实验报告。
关键词：southern杂交；DNA提取；PCR扩增；凝胶电泳
：（略）

实验材料
暗培养7天的小麦幼苗（黄化苗），含质粒的大肠杆菌P38
试剂

Trizol Reagent（Trizol试剂盒）
氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC(含有RNA灭活酶)处理的ddH2O，溴乙锭（EB）10mg/ml，点样缓冲液Loading buffer(10×)（%溴酚蓝，40%甘油）。
RT-PCR扩增目的基因cDNA
RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），Taq酶及PCR缓冲液（10×），引物（P1、P2）。
小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析
DNA抽提液（CT-AB）
用时将下述三种溶液按1:1: (V/V)比例混匀，加入亚硫酸氢钠（），即为抽提液。
① DNA extraction（500ml）：
sorbitol(山梨醇)
Tris (一般不调)
② Nuclei lysis buffer（500ml）:
100ml 1M Tris
100ml EDTA
200ml 5M NaCl
10g CTAB
100ml ddH2O
③5OOml 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐)
氯仿：异戊醇（24：1） 70%乙醇 异丙醇 HindIII酶 EcoRⅠ酶
质粒DNA提取
质粒小提试剂盒（天安公司，中国产）
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，。高压灭菌20分钟。
LB平板培养基：在每1000mL LB液