碱性磷酸酶km值测定.ppt

酶促反应动力学研究方法介绍
EXPERIMENT 3
碱性磷酸酶km值测定
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实验目的
学习环境因素对酶促反应速度的影响；
学习米氏方程及Km值得测定；
测量碱性磷酸酶km值；
实验原理
E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包
括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等
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（一）米－曼氏方程式
中间产物
酶促反应模式——中间产物学说
E + S
k1
k2
k3
ES
E + P
相关E学原理
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※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式( Michaelis equation)。
[S]：底物浓度
V： 不同[S]时的反应速度
Vmax：最大反应速度(maximum velocity)
Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
Ｖ
Vmax[S]
Km + [S]
＝
──
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米－曼氏方程式推导基于两个假设：
(1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V＝k3[ES]。
(2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
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推导过程
稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。
K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES]
K2+K3
＝ Km （米氏常数）
K1
令：
则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES]
(2)
＝
([Et]－[ES])[S]
K2+K3
[ES]
K1
整理得：
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当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度
Vmax＝K3[ES]＝K3[Et] (5)
[ES]＝───
[Et][S]
Km + [S]
(3)
整理得:
将(5)代入(4)得米氏方程式：
Vmax[S]
Km + [S]
V＝────
将(3)代入(1) 得
K3[Et][S]
Km + [S]
(4)
V＝────
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当反应速度为最大反应速度一半时
Km值的推导
Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。
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＝
Km + [S]
Vmax
Vmax[S]
Vmax
V
[S]
Km
Vmax/2
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（二）Km与Vmax的意义
Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
② 意义：
a) Km是酶的特征性常数之一；
b) Km可近似表示酶对底物的亲和力；
c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
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Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。
意义：Vmax=K3 [E]
如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。
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