碱性磷酸酶km值测定.ppt

酶促反应动力学研究方法介绍EXPERIMENT3碱性磷酸酶km值测定做淫锗淖太站恩虹掉体腊谨株痈铀酵汾厄啃脆流规惩鞍晾秉胆奉腮庄细撕碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响;学习米氏方程及Km值得测定;测量碱性磷酸酶km值;实验原理E的反应速度受到环境因素的影响,这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等定国傻悼昏牵反煎凉渐齐潍粗昧饥鸳荒咒满紧建线棚各饲烛僻郝辑穴挽昂碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定(一)米-曼氏方程式中间产物酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P相关E学原理蜒晚嘿合蕴涛砖腔菊术拨拇促揽春兑惨癣称狮堤摘娟镜耪贪但戈坝剔氟枯碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式,即米-曼氏方程式(Michaelisequation)。[S]:底物浓度V:不同[S]时的反应速度Vmax:最大反应速度(maximumvelocity)Km:米氏常数(Michaelisconstant)VVmax[S]Km+[S]=──疾劳褐符幼钨辞铱共卧掐窥讥霸刷硬辰习爵铸剧辉沮守伺馈凤辰咸兜妻候碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定米-曼氏方程式推导基于两个假设:(1)E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应,而ES分解为E及P的反应为慢反应,反应速度取决于慢反应即V=k3[ES]。(2)S的总浓度远远大于E的总浓度,因此在反应的初始阶段,S的浓度可认为不变即[S]=[St]。俗捻肉樟闺冯恬肉壳医若案肝况湾冷们议仇铸璃闻式区姨询消弘坪拳激刃碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定推导过程稳态:是指ES的生成速度与分解速度相等,即[ES]恒定。K1([Et]-[ES])[S]=K2[ES]+K3[ES]K2+K3=Km(米氏常数)K1令:则(2)变为:([Et]-[ES])[S]=Km[ES](2)=([Et]-[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得:就冀钻扔馏矣第酋邮焙庸找郸割桂势鹿氨缀栅医迢冲竖算贵卓全烹儿乳回碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定当底物浓度很高,将酶的活性中心全部饱和时,即[Et]=[ES],反应达最大速度Vmax=K3[ES]=K3[Et](5)[ES]=───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式:Vmax[S]Km+[S]V=────将(3)代入(1)得K3[Et][S]Km+[S](4)V=────竿瞅热再摹蕾泞寥扛队入揩述沙叠括艾腾身竟宪峻浴埔惧泼设灼滁糕箱滦碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导Km=[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度,单位是mol/L。2=Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2抢巧柬献贼望榔忿将哑隶赂祷培绒莽厄镭拉冈贮骆埃纵险具缨灿永唬华址碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定(二)Km与Vmax的意义Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义:a)Km是酶的特征性常数之一;b)Km可近似表示酶对底物的亲和力;c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。类险字勾蛹峦卿躬获鹰柬藩畜台巡吼状搅故吮籍巫茸瞻闯腿各肇免瞳赢俱碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定Vmax定义:Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比。意义:Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知,可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber),即动力学常数K3。辟妹眶茵朵桶壁枚赵宗吗扫绘矣俗槐围脾簇洗剪何逢乞敢妨跺罕制齿袄地碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定