碱性磷酸酶km值测定.ppt

酶促反应动力学研究方法介绍
碱性磷酸酶km值测定
实验目的
学习环境因素对酶促反应速度的影响;
学习米氏方程及Km值得测定;
测量碱性磷酸酶km值;
实验原理
E的反应速度受到环境因素的影响,这些因素包
括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等
(一)米-曼氏方程式
中间产物
酶促反应模式——中间产物学说
E + S
k1
k2
k3
ES
E + P
相关E学原理
※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式,即米-曼氏方程式,简称米氏方程式(Michaelis equation)。
[S]:底物浓度
V:不同[S]时的反应速度
Vmax:最大反应速度(maximum velocity)
Km:米氏常数(Michaelis constant)
V
Vmax[S]
Km + [S]
=
──
当反应速度为最大反应速度一半时
Km值的推导
Km=[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度,单位是mol/L。
2
=
Km + [S]
Vmax
Vmax[S]
Vmax
V
[S]
Km
Vmax/2
(二)Km与Vmax的意义
Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
②意义:
a) Km是酶的特征性常数之一;
b) Km可近似表示酶对底物的亲和力;
c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
Vmax
定义:Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比。
(三)Km值与Vmax值的测定
1. 双倒数作图法(double reciprocal plot),又称为林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
-1/Km
1/Vmax
1/[S]
1/V
Vmax[S]
Km+[S]
V =
(林-贝氏方程)
+
1/V=
Km
Vmax
1/Vmax
1/[S]
两边同取倒数
2. Hanes作图法
[S]
[S]/V
-Km
Km/Vm
在林-贝氏方程基础上,两边同乘[S]
[S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax
酶浓度对反应速度的影响
当[S]>>[E],酶可被底物饱和的情况下,反应速度与酶浓度成正比。
关系式为:V = K3 [E]
0
V
[E]
当[S]>>[E]时,Vmax = k3 [E]
酶浓度对反应速度的影响