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单抗抗血管新生及抗肿瘤作用研究..课题来源:国家“ㄌ庀钅人源性抗固逡┪镅芯学位申请人导师答辩委员会主席答辩委员会成员免疫学吴长有教授富宁教授陈政良教授邹李康生教授阎锡蕴教授钟雪云教授罗荣城教授“抑制肿瘤血管新生专名称指教李丹向军俭教授王宏副教授强教授车小燕教授论文评阅人年广州业月南方医科大学级博士学位论文日
单抗抗血管新生及抗肿瘤作用研究..博士研究生:李丹指导教师:向军俭教授摘要研究背景和目的碱性成纤维细胞生长因子琤是成纤维细胞生长因子家族中的一员,它作为一种广泛的有丝分裂原,可通过自分泌或旁分泌的方式促进多种细胞,包括肿瘤细胞,血管内皮细胞的增殖、分化。易成员主要通过与其高亲和力受体的结合向细胞内传递信号,发挥其生物学活性。高亲和力受体又称受体酪氨酸激酶,嬖闹值鞍住挥隖岷贤饪与其他几类亚型包括,,也現現结合。,与其结合后,通过二聚化而发生自身磷酸化,活化的可招募一些接头蛋白,从而激活下游的信号通路,包括疎/琍丫/龋笳哂只罨B家蜃蛹坝胂赴芷冢蛲觯沟蛲觯细胞骨架等相关的蛋白,从而调节细胞的生物学活性。及高表达于包括黑色素瘤,肺癌在内的多种肿瘤组织,且与肿瘤的转移、分期、预后相关,/系统成为抗肿瘤治疗的新靶点。血管新生过程是从已存在血管中长出新血管的过程。肿瘤血管新生不仅为肿瘤生长提供营养,更是肿瘤发生转移的物质基础。肿瘤血管新生的过程包括内皮细胞增殖,内皮干细胞的迁移,内皮细胞的迁移和侵入,内皮细胞的增殖,内皮细胞在管状结构中的组织,循环系统的形成,血管的成熟,血管的退化等。作为重要的促血管新生因子在血管新生过程的多个环节发挥作用。南方医科大学博士学位论文現,一▲』●●···‘
方法黑色素瘤是皮肤癌中最致命的一种,近年来在西方国家其发病率和死亡率持续增加。肺癌在我国及世界许多国家高发,且成为癌症的第一杀手。黑色素瘤对放化疗药物中度敏感,且容易产生耐药,黑素素瘤的耐药性及其高转移率是导致其很难治愈的重要原因。因此新的治疗手段尤其是靶向生物疗法备受关注。及在黑色素瘤组织中高表达,与其转移及预后密切相关,有学者甚至认为病人血清及组织中的水平可作为肿瘤预后的重要指标。可通过自分泌的方式促进黑色素瘤细胞及肺癌细胞的增殖。正常黑素细胞不表达,然而其体外培养则必须有外源性的加入,而且将基因转入正常黑素细胞使其高表达,可出现类似于黑色素瘤早期的表型;除此之外还是具有抗凋亡作用,可抵抗饥恶及化疗药物诱导的靶细胞凋亡。肺癌的发病率和死亡率在我国乃至世界许多国家居于首位,其高转移率及对放化疗药物的耐药是肺癌患者死亡的重要原因。且目前传统的治疗方法主要针对早期肺癌患者,对于晚期患者则难以治愈。因此近年来新的治疗手段,尤其是靶向抗体治疗备受关注。有研究表明在非小细胞系肺癌组织中表达率高于%,且与淋巴结转移及分期相关,其在伴有淋巴结转移及中晚期肺癌组织中的表达明显高于早期。有研究证明是多种肿瘤的广谱耐药机制。导致肺癌细胞对化疗药物耐药的原因在于不仅能促进肺癌细胞的增殖,还可使其逃避化疗药物诱导的凋亡。因此可能成为肺痛治疗的良好的靶点。因此本研究以血管内皮细胞,黑色素痛细胞,肺痛细胞为研究对象研究单抗的体内外抗血管新生,及抗肿瘤作用。産タ箍寡9苄律饔将本室保存的多株产生抗单抗的杂交瘤细胞克隆化后,扩大培养,注射福氏不完全佐剂处理过的小鼠腹腔,制备腹水型单克隆抗体。蛋白缀层析柱纯化单抗,间接ḿ觳馄溆隻慕岷匣钚约坝隺是否存在交叉反应。另外将天然及巯基乙醇处理后热失活的包南方医科大学博士学位论文
板,用间接ḿ觳獾タ故侗鹂乖砦弧V挥胩烊籦从Γ挥热失活的反应的单抗识别的是的窄间表位;相反可与二者都结合的单抗识别的的线性表位。将单抗与咔缀土κ芴錐混合后加入已包被有的逯校ü。另外将单抗与肝素混合混合后加入已包被有的褰恚ü赫鵈法检测单抗是否能够抑制与肝素的结合,如果抑制说明单抗识别肝素结合相关区域。取原代脐静脉血管内皮细胞以刺激其增殖,同时加入单抗,法检测此单抗对促进的血管内皮细胞增殖的影响;将血管内皮细胞接种到已铺上基质胶的细胞培板中,加入及和单抗的混合物,培养缶迪录剖獗盏墓茏唇峁梗约觳鈈タ苟血管内皮细胞成管的影响;ḿ觳獾タ苟匝9苣谄は赴ㄒ频挠跋欤9苣谄は赴尤∈业纳鲜抑校率壹尤牒痬腗耆嘌导上室中血管内皮细胞向下室的迁移,另外加入单抗检测其对迁移的影响,蠹D啡旧ǎ寥ド喜阆赴剖ㄒ频南赴孔板中接种血管内皮细胞,贴壁后加入单抗作用占谏瘤细胞,加入单抗处理过的血管内皮细胞中,笙窗澹饩迪乱颜掣的黑色素瘤细胞数,以检测单抗对血管内皮细胞与黑色素瘤细胞粘附的影响:取樟浼ε撸匝揽谱昕4埃┞赌蚰夷ぃ灾兴俣ㄐ月酥轿T靥寮尤隻和单抗,作用旌螅渭拥攘考