过氧化氢促大鼠肝卵圆细胞株WB-F344增殖、转化及其机理研究.pdf

%’.·双..苯基恶唑勘聚乙烯吡咯烷酮活性氧超氧化物歧化酶,.——中国协和医科大学博士学位论文甅虸卜%琋,琋,籄瓵瓻籥,琭’猠猰猘,臫.
、多发病,肝癌在整个人类恶性肿瘤发病中占有非常重要的地位。许多研究表明化学因素与肝癌的发生密切相肝卵圆细胞株—来自正常成年同基因坌源笫螅且恢指卧幼稚上皮细胞,具有肝脏干细胞的性质,体内、外的许多研究表明,它与肝癌的发生有一定的关系,具有肝癌前体细胞的作用。,但以活性氧直接作用导致其恶性转化的研究尚鲜见报导。为进一步确证活性氧在肝癌发生中的作用,本文研究了篛:促体外培养的肝卵圆细胞赴增殖及转化作用,并首次从细胞膜、胞浆内信号转导、细胞核内基因转录及其相互间联系等方面探讨其作用的分子机理可具体工作分为五个部分:第一部分篛:促细胞增殖、转化的研究:捎梅从诚赴鲋持副甑牟同实验方法,获得一致的结果〖亮康腍:疞淮巫饔糜诰蚕⑵赪细胞,壬笛橄允酒墓馕毡戎翟黾樱砻骰钕赴吭龆啵甌抑制。此外,从形态学观察分析的结果还显示中等剂量的疞哂兄苯拥南赴咀饔茫鯳赴⑸芙饣邓馈K得鞑煌亮的鹤饔糜赪赴赡芑岵煌纳镄вΑ关,但对其致病机理并不十分清楚。有研究显示自由基、活性氧可能参与了肝癌的发生过程,但尚未有确切的证据,尤其是在体外细胞和分子水平的研究,报道甚少。,细胞增殖;染色形态学观察分析的结果显示细胞核分裂增加。以上实验均证明了小剂量的篛:有明显的促进细胞增殖的作用,且这种增殖作用可以被实验中加入的过氧化氢酶疞梢起培养的细胞散在性固缩坏死,符合凋亡的形态学改变,而大剂量的图亮康腍饔糜诘中国协和医科大学博士学位论文,、
主旦坠塑匿型盔堂塑圭堂笪堡塞血清培养条件下%的正常细胞途е掳┪颩启动过的细胞.,每天作用一次,经次连续作用后,以多种指标进质比例增大,核仁清晰,数目增多,生长的极性消失,常有重叠生长,可见散在的转化灶,表明接触抑制性的丧失;诵头治觯涸谌旧迨糠矫妫赴醒嵌体、亚四倍体等非整倍体细胞及多倍体细胞的数量显著增加;在染色体结构方面,出现更多的染色体结构畸变,如单体断裂、双着丝粒、双微体及裂隙等,其畸变率显著升高;谆宋靼牍烫迮嘌合赴稍谂嘌行纬煽寺。移淇寺⌒成率与篛:的作用次数之间呈正相关,随着篛:作用次数的增加,其克隆形成率逐渐增加,表明其停泊依赖性的丧失。根据以上结果可见小剂量的篛:具有完全的第二部分篛:促细胞增殖、转化过程中对细胞膜理化特性、膜脂质过氧化及基因组挠跋欤夯钚匝醮傧赴鲋场⒆;幕砟壳盎共磺宄芯縃:的意义。本部分侧重研究了篛:对细胞膜理化特性、膜脂质过氧化及基因组的影响。已知细胞膜是细胞转导外界刺激的首要环节,其理化特性的改变和膜脂质过氧化是细胞开始信号转导的重要指标,膜蛋白构象的改变,是细胞受外界刺激的最早反应,观察膜脂、膜蛋白理化特性改变和脂质过氧化,对研究篛:作用于细胞产生生物效应的过程具有很重要的意义。本实验首先以和直鸨昙膜蛋白和膜脂,通过检测所标记细胞膜被标记物的荧光偏振度改变,比较篛:作用引起膜脂、膜蛋白流动性和分子运动度的改变,以此确定篛:在促细胞增生、转化剂量的条件下对其膜理化特性的影响;进而以溴化乙锭作为荧光探针,检测了琌,对斐傻亩狭阉鹕耍⒃谕暾鸚赴窖芯苛薍:致膜脂质过氧化及诱导基因组鹕说淖饔谩=峁⑾ù的细胞其蚇一挠ü馄穸染杂薪档停得髂ぶ是鞫栽龈撸膜蛋白运动度亦增高。可能由于细胞膜脂质区域和蛋白质区域均受到一定影响,使膜脂质和膜蛋白的结构、构象发生改变,从而导致膜流动性增高:毙〖亮縃:行恶性转化验证,结果发现:翁Х矫妫合赴翁涞貌还嬖颍笮〔坏龋致促癌作用。促细胞增殖、转化的机理,对于了解活性氧在肝癌发生中的作用具有十分重要/
第三部分簅:对细胞膜上离子通道的作用及与胞内游离钙离子的关系:作用过多次以致细胞发生转化后,ü馄穸仍蛎飨越档停说明此时细胞膜脂质和膜蛋白改变更甚,导致膜流动性更为增高;恐掳┘对荧光强度与对照组相比则无明显差异,说明此时细胞膜虽有脂质过氧化,但显,瓻岷衔