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实验二细菌的鉴定方法
细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。
表型鉴定法是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。
分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA进行分析,包括G+Cmo1% 含量测定、核酸杂交、PCR技术、16SrRNA和16~23SrRNA序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。
一、细菌常规鉴定法
细菌常规鉴定法是细菌形态和生理生化水平及蛋白质水平的鉴定,前者是最经典、最常用的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,后者包括免疫诊断技术、蛋白质图谱分析和氨基酸序列分析等。
免疫诊断技术
凝集试验目前常用的是葡萄球菌协同凝集试验(SPA—CoA),金黄色葡萄球菌细胞壁的A蛋白(sPA)能与动物血清中IgG的Fc结合,成为致敏的颗粒载体,特异性IgG的Fc与SPA结合后,F(ab’)2段暴露在葡萄球菌表面,与相应细菌反应呈现凝集现,此法用于细菌快速鉴定和分型。
免疫酶技术。免疫酶技术(EIA,Enzyme immuno assay)是将酶标记的抗抗体与抗原一抗体复合物结合形成抗原一抗体一酶标记抗抗体复合物,加入酶底物产生有色产物。以酶联免疫吸附测定(ELISA)和斑点酶联免疫吸附技术(Dot—EusA)应用较广泛。
免疫荧光技术免疫荧光技术(FIA,Fuorescence immunoassay)是将一抗滴加于待检抗原上,再加一抗的荧光抗体(二抗),呈现特异性的荧光抗原抗体复合物以鉴定病原菌。此法比ELISA更直观,可直接观察到菌体形态。
放射免疫测定技术。放射免疫测定(RIA,Radio immuno assay)是用放射性同位素标记抗原或抗体,与相应的抗体或抗原结合后通过放射自显影定性和定量抗原或抗体。
免疫胶体金标记技术。胶体金是继酶、荧光素和放射同位素后免疫标记技术中令人瞩目的新标记物。胶体金是氯金酸(HAuC14)在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的作用下,聚合成特定大小的金颗粒,通过静电作用与抗体或抗原形成一种稳定的胶体状态,即为免疫金,免疫金与相应的抗原抗体结合后,呈现特定的颜色反应。
蛋白质图谱分析
蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE,Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS—PAGE。聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺(Acr)和N,N’一亚甲双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻长链通过甲叉桥连接形成三维网状结构物质,PAGE根据电荷、形状和分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。SDS—PAGE根据分子量的不同分离蛋白质,SDS是一种阴离子表面活性剂,与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且使蛋白质的形状趋向一致,抵消了蛋白质本身所带电荷和形状的影响,因此,样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。
二、细菌的数值分类和自动化鉴定
数值分类法是近20年来发展起来的细菌分类理论,它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析,优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂,根据相似系数大小判断细菌种属间的亲源性。
自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。微生物数值分类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体,具有系统化、标准化、微量化和简易化等优点,采用商品化的鉴定测试卡,将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型,可对不同来源的临床标本进行针对性鉴定,所得结果以数字方式表达,与数据库数据(手册或软件)对比得出鉴定结果。
目前应用较多的自动化鉴定系统主要有:Vitek—AMS(Automated Microbic System ) 、Biolog、MicroScan、Enterotube、MIDI、Sensititte、Autoseeptor、Crystal等鉴定系统。
法国生物一梅里埃(Bio—Merieux)公司的Vitek—AMS系统是应用最普遍的细菌自动化鉴定系统之一,可鉴定18 000多种细菌。全自动鉴定是从接种、培养、读数到报告的全过程自动完成,利用负压将菌液加入测试卡各孔,封口机封口,置孵箱孵育,阅读器以665 nm波长每小时将测试卡拉出1次对各孔底物进行光扫描,动态观察其变化,计算机将判读结果与标准数据库比较得出鉴定结果。
“Bidog”细菌鉴定系统由不同氧化还原指示剂和发酵性碳源的培养基干粉组成96孔细菌培养板。将待检菌的新鲜纯培养物配制成适当浓度的菌悬液,由多头接种器快速完成96孔接种,37 ℃培养4~24 h,置检察室的分光光度计中检测,计