实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳
分子生物学实验
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一 实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,也是现在通用的许多分子生物学研究方法,如:
DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础,受到科学界的高度重视。
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二 实验原理
DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
核酸为两性分子,,整个分子带正电; pH8左右时,整个分子带负电。
在碱性环境下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的,把这些核酸分子放置在电场当中,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,可以近似用于估算分子的大小。
可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA。
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二 实验原理
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凝胶类型及浓度
分离DNA片段的大小范围(bp)
%琼脂糖
50 000~1 000
%琼脂糖
20 000~1 000
%琼脂糖
6 000~300
%聚丙烯酰胺
1 000~100
%聚丙烯酰胺
500~25
%聚丙烯酰胺
50~1
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关,凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。反之,浓度降低,孔隙就增大,其分辨能力也就随之减弱。
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DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。
~50kb之间
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EB(溴化乙锭) 能插入DNA分子碱基对之间,导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB,或者结合的EB本身在300和360吸收的射线,均可在可见光区以590波长发射出来,呈橙红色。~1μg.
EB染料优点:染色操作简便,快速,室温下15-20min;不会使核酸断裂;灵敏度高,10ng或更少的DNA即可检出;可以加到样品中或胶中。
EB是诱变剂,使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。
在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光
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三 实验步骤
称样
溶解
加热
制板
倒胶
取样
点样
电泳
检测
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三 实验步骤
制胶 —— %琼脂糖凝胶 (50ml)
凝胶板的制备 ——小心加入2-3μlEB,摇匀(污染EB吸头,不宜再回收使用)
点样—— 样品10μl,与4μl溴酚兰混匀
电泳—— 60v, 大约50-60min
观察和拍照——254nm紫外灯下观察
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四 实验结果
五 注意事项
EB是一种诱变剂,操作时必须戴塑料或乳胶手套!!!
六 习 题
琼脂糖凝胶电泳的适用范围?
?
4 泳道 maker
1 泳道 质粒DNA
2、3、5、6泳道 酶切产物
1 2 3 4 5 6
质粒
酶切片段
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