小鼠骨髓微核试验.doc

小鼠骨髓细胞微核试验
一、目的与要求
1、 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。
2、 学习与掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤,嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。
3、 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。
二、实验原理
微核与染色体损伤有关,就是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期遗留在细胞质中,末期之后,单独形成一个或几个规则的次核,包含在子细胞的胞质内,因比主核小,故称微核。
无论就是断片还就是整条染色体,其实质都就是遗传物质,一但发生畸变,就有能形成遗传物质方面的问题,造成突变,因此,微核的检测实质上就就是遗传物质突变的检测,现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。
微核试验就是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂与非整倍体诱变剂。
传统的微核试验就是体内试验,它观察骨髓嗜多染红细胞(PCE)中的微核。微核可位于多种细胞,但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分,所以只有在无核的红细胞中才易辨认。在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞(呈灰蓝或浅蓝色)与成熟红细胞(呈粉红或桔红色)两种,正常情况下嗜多染红细胞占多数,所以观察骨髓嗜多染红细胞。PCE指在红细胞成熟之前,最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞,但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体,因此Giemsa染色呈灰蓝色,成熟红细胞的核糖体已消失,被染成淡橘红色,使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC(NCE)有所不同。微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成,也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。
三、实验设计
1、 动物选择:常用小鼠,体重18~20 g,7~12周龄,每组10只,雌雄各半。
2、 染毒途径:原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。
3、 染毒次数及取样时间:一般采用两次染毒或多次染毒。两次染毒:第1次染毒后24小时进行第2次染毒,6小时后取样;多次染毒:每天染毒1次,连续染毒5天,末次染毒后24小时取样。
4、 剂量选择:至少设置3个剂量组。高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50剂量。当受试样品的LD50大于5 g/kg时,可取5 g/kg为最高剂量,以下设3~5个剂量组。另设溶剂对照组(阴性对照组)与阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺(50~100 mg/kg)或丝裂霉素C(10 mg/kg)腹腔注射1次。
四、操作步骤
1、 骨髓液的制备及涂片
颈椎脱臼处死小鼠,取胸骨,擦净血污,剔去肌肉,剪去骨骺,将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片一端,另取一块边缘整齐的载玻片,在血清上轻轻按摩,使骨髓完全混匀,然后以45~50度角快速推片,推片后在空气中晾干。
2、 固定
将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15分钟,晾干。