膜联蛋白家族新成员克隆及其结构与功能研究.pdf

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要摘咱靦表达载体构建猪囊尾蚴文库,其中有一个克隆赏北物细胞内,有着十分广泛且重要的生理功能,如参与细胞骨架运动、调节细胞生长、其核酸和氨基酸序列进行同源比较和分柝,发现它实际上是~新的易宄稍薄作为扁形动物门首次发现的易宄稍保芯縜不仅可以了解其对猪新的药物靶点,而且可以为整个易宓难芯刻峁┯幸庖宓囊糯ḿ胺肿咏组化方法研究的阶段特异性表达和组织定位;采用计算机同源模建、定点及缺失突变、蛋白晶体培养等技术研究峁褂牍δ艿墓叵担翰捎弥侍骞的主要生物学活性。ü鼴同源性检索,发现隺家族成员高度同源;进索蛋白质结构域数据库,发现它具有龅湫偷腶重复结构域,每个重复结构型结合位点;对其二级结构进行预测,发砚该蛋自主要以菪V鳎廾飨钥缒で扌藕烹模崾酒湮0鞍祝庑┚隺特征相符。将嗦胄蛄锌寺≈猎吮泶镌靥錺缀筒阄龃炕蟮玫狡淙诤合。以上证据表明粲赼家族,又由于其擞胂钟衋家族成员膜联蛋白易迨且焕喔屏字岷系鞍壮易澹嬖谟诖蠖嗍婧松形成膜离子通道、参与细胞信号转导等。这类蛋白结构上具有明显特征:吮J厍大多由旺螺旋组成,其中含有主要的磷脂结合活性位点:宋?杀淝煌族成员诵蛄凶槌杉俺ざ雀鞑幌嗤是我们以免疫筛选法从猪囊尾蚴文库分离得到的新基因。将囊尾蚴寄生、移行、生长、发育等生命活动的重要意义,为预防和治疗该类疾病提供资料。所以接下来我们构建了的融合及非融合表达载体,在大肠杆菌中实现了高表达,利用亲和层析及离子交换层析技术纯化蛋白;采用印迹和免疫沉淀、活化血小板结合、凋亡细胞结合实验以及建立血栓动物模型等方法研究本研究主要结果如下:囊尾蚴病人及病猪血清识别,该克隆含有开放阅读框,编码霭基酸,计算分子量为域包含一个蛋白,脂质体共沉淀实验表明赾嬖谇榭鱿驴梢杂肓字K堪彼步搜级博士研究生论文摘要。
片断,提取囊尾蚴和成虫不同节片,甲组化检测,,其中&螺旋菪膌嗷タ拷餐槌梢桓霰J氐母平岷衔坏恪=玜的四个同源结构域进行结构叠合,发现琹琁峁褂蚣O嗨疲结构域同上述鼋峁褂蛳嗨菩越系汀结构中一些关键残基对其活性的影响,明确主要磷脂菌中进行表达和纯化。采用脂质体共沉淀实验研究这些突变体的磷脂结合活性。结果位点联合起来突变的蛋白可进一步降低该活性,当突变位点达到龌蛞陨鲜保ブ岷匣钚曰救ú可ナАL崾荆赫庑┪坏悴斡牍钩蒩要结合位点,并且以第一个结构域的遠结合位点对巳笔Ф云淞字岷匣钚杂跋觳淮蟆鞍拙迮嘌把苌浼际蹩梢曰竦迷臃直媛氏耡信息。为获高质量结晶用蛋白,构建了ü迥凇⑼庋Kǘ锬P褪笛橹な礱具有抗凝血及抑制【ㄐ纬作用,实验动物体内给药后,血栓的长度、重量与阴性对照相比均有明显减少。与网端都不相同,所以它是一个新的易宄稍保輆家族的统一命名规则,将其命名为浴癙标记醛变性凝胶电泳后转移硝酸纤维素膜,与猘探针杂交,放射自显影结果显示,只在囊尾蚴有强的杂交信号,说明为囊尾蚴阶段特异性表达基因。制备多克隆抗体,将固定的新鲜囊尾蚴脱水。冰冻切片后行免疫輆家族其它成员晶体结构,采用同源蛋白模建技术构建三维结构。结果显示:,构建了一系列单点突变体、、约傲:贤槐涮錗、、、谋泶镌靥宀⒃诖蟪Ω显示,可显著地降低的磷脂结合活性,其次为、,将这些性最为重要。我们还同时构建了巳笔槐涮澹椒ḿ觳獗砻的原核非融合型表达载体,通过优化的两步离子交换层析锝到高纯度全长蛋白,进行了迮嘌跫鳎获得蛋白单晶。的与的磷脂结合活结构最完整的主级博士研究生论文摘要
的活化血小板结合实验较直接地说明了化血小扳是动脉血栓的主要成分,而畁对活化血小板有高的亲移力,所以还期,膜脂质即发生翻转,由细胞膜内侧转移至膜外侧。采用肾上腺皮质激素类药析和荧光显微镜检测均发现关键词:膜联蛋白,猪囊尾蚴,结构与功能关系,同源模建。突变体,生物活性等药效的肝素相比,对凝血系统影响小,出血等副反应发生率低。接下来与活化血小板的相互作用。因为活可以考虑把它用于血栓的导向显像,或以此为载体发展血栓靶向性的溶栓药物。的磷脂结合活性使它能够识别早期凋亡细胞,在细胞凋亡早物和抗肿瘤药物分别诱导太鼠胸腺细胞、细胞、细胞凋亡,流式细胞仪分可特异识别凋亡细胞对其进行检测,具有处理细胞量