第10章 分子生物学实验技术.doc

第十章分子生物学实验技术
第一节基因操作
引言
一、什么是基因操作
核心部分为cloning
大多数西方国家对此都有一个精确的法律定义(由于政府对之的法律约束)。
将在细胞外产生的核酸分子插入病毒, 质粒或其它载体系统中,再整合到那些本来不含该类物质的宿主中,从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
基因操作的重要特征
外源核酸分子(一般为DNA)在不同宿主中的繁殖
打破自然种的界限
将来自不相关物种的基因放入一个宿主中
概念的延伸: 个体内部基因的增加或减少
我们这里所说的基因操作并不是一个法律概念,除了包括基因克隆外,还包括基因的表达,调控,检测等,与基因研究相关的内容。
二、基因的基本概念
基因是遗传信息的基本单位
从物质结构上看,基因是染色体组核酸分子
基因是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段,可以是连续的,也可以是不连续的,可以是DNA也可以是RNA,可以存在于染色体上,也可存在于染色体之外(如质粒、噬菌体等)
三、基因的基本结构组成
编码区 ORF
启动子 promoter
RBS ribosomal binding site
终止子 terminator
flanking sequence 侧翼序列
upstream / downstream
Cap/tail 帽/尾
DNA 克隆
克隆一词是英文单词clone的音译,作为名词,c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的,例外仅见于有突变发生时。
自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆,例如:同卵双胞胎实际上就是一种克隆。
作为动词,cloning是指用人工方法产生无性繁殖系的一系列操作过程。
DNA cloning (DNA 克隆)的定义
将基因组中携有目的基因或其他相关序列的较小片段连接到一段可以自主复制的DNA即载体(vectors)上,形成通常可以在另一宿主中进行复制的重组DNA(binant DNA),这种复制是独立于原初基因组的。带有重组DNA的宿主(Hosts)
细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体,或称为单克隆。这一系列操作过程被称为DNA克隆。
Blotting the DNA or RNA on a membrane
Hybridize the labeled probe with DNA membrane (Southern) or RNA (Northern) membrane
第二节基因工程工具酶
基因工程的操作,是在分子水平上的操作,是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶,连接酶,DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割,拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株(或真核生物如酵母)进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
基因工程工具酶
自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢,在核酸复制和修复等反应中具有重要作用,有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。
在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后,人类获得了最好的基因工程工具。
基因工程工具酶

1 限制性核酸内切酶
(restriction enzyme)
本节内容:
限制性内切酶的发现
限制性内切酶的分类
限制性内切酶的命名
限制性内切酶的活性单位
限制性内切酶的切割特点
限制性内切酶的反应条件
限制性内切酶的应用
当λ(k),由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列,被降解掉。
,但可在EcoB甲基化酶的作用下,催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基,使之甲基化。
EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
仍有少量phage λ(K)可在 E. coli B中生存, B phage对λ(K)进行了修饰。
R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶,构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA,为避免自身
DNA的降解,细菌可以修饰(甲基化酶)自身DNA,未被修饰的外来DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰,则可免予被降解。
限制性核酸内切酶的发现
1968 B中发现限制酶Ⅰ
1970 Smith(美)在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ
1978 W. Arber,H. ,Na