10外源基因表达产物的分离纯化.ppt

A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
10 外源基因表达产物的分离纯化
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
多种分离纯化技术的联合运用
合适分离纯化介质的选择
分离纯化过程的规模化
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应在
纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理;
采用包涵体型战略表达重组蛋白,应先离心回收包涵体;
采用融合型战略表达重组蛋白,一般是胞内可溶性的,拟首先选
用亲和层析进行纯化
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质,应用低浓度的溶
菌酶处理,然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域(pI≤5 或 pI≥8)的重组蛋白应首选离子
交换法进行分离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白;
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析
纯化方法的重要条件,原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合
适的范围内(10-8- 10-4 mol / L);
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的;
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的;
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种
复合技术,在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。
多种分离纯化技术的联合运用
在进行重组蛋白的纯化时,通常需要综合使用多种技术,一般来
说,在选择分离纯化方法时应遵循下列原则:
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分
离纯化介质应具有下列性质:
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定,重复性好
价格低廉
分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程
未必合适,如:
实验室方法在工程上可能难以实现(超声波破细胞壁)
实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心)
因此,在很多情况下,实验室的技术路线不等于生产工艺。
B 离子交换层析
10 外源基因表达产物的分离纯化
离子交换层析的基本原理
离子交换介质的基本性质
离子交换层析的基本操作
离子交换介质的选择原则
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子溶液为
流动相,利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异,而将混
合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换剂亦称离子交换介质,通常是一种不溶性高分子化合物
如树脂,纤维素,葡聚糖,醇脂糖等;
离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳
离子交换剂的基本性能
离子或阴离子起交换作用
如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上,则在用洗脱液洗
脱时,各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数
吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去
电荷而解离下来
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同,即亲和力大
小有差异,因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个
洗脱下来,达到分离纯化的目的
离子交换介质的基本性质
阴离子交换剂:强碱型和弱碱型
可电离的基团 磺酸基(-SO3H)
离子交换剂的分类
磷酸基(-PO3H2)
羧酸基(-COOH)
酚羟基(-OH)
阳离子交换剂:强酸型和弱酸型
可电离的基团 伯胺基(-NH2)
仲胺基(-NHCH3 )
叔胺基(-N(CH3)2)
季胺基(-N+(CH3) 3 )