2021年进境辣椒中低龄辣椒实蝇幼虫的判定实蝇.docx

进境辣椒中低龄辣椒实蝇幼虫的判定实蝇

　　 　　摘要：自菲律宾进境旅客携带的小红辣椒中截获1头低龄实蝇幼虫。分别用辣椒实蝇Bactrocera lati-frons、橘小实蝇B. dorsalis和地中海实蝇Ceratitis capitata的特异性引物lati1/lati2、PF-1/PF-2和CCCA-COL-L/CCCA-COL-R对样品总DNA进行PCR扩增和测序后，和Genbank中已知序列比对，结果表明该实蝇和Genbank中辣椒实蝇的同源性达99%。结合形态学特征，确定截获的样本为辣椒实蝇Bactrocera latifrons。
　　关键词：辣椒实蝇Bactrocera latifrons；低龄幼虫；形态学判定；分子生物学判定
　　中图分类号：S41-30 文件标识码：A 文章编号：0439-8114202118-4385-03
　　辣椒实蝇Bactrocera latifrons、橘小实蝇B. dorsalis和地中海实蝇Ceratitis capitata属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae，其中辣椒实蝇和橘小实蝇属果实蝇属Bactrocera，关键分布在东南亚地域；地中海实蝇属小条实蝇属Ceratitis，原产西非，现已随果蔬传输到90多个国家和地域1。这3种害虫的形态和寄主全部十分相同，可为害多个水果和蔬菜，关键以幼虫寄生在果实内造成危害。此3种昆虫均为国际上关注的含有主要经济意义的害虫，中国已将其列为进境植物检疫性有害生物2。多年来，中国口岸常常从泰国、菲律宾、越南等东南亚地域进境的水果和蔬菜中截获这3种害虫3-8，所以，这类害虫随进境果蔬传入中国的风险极大，严重威胁中国农业生产安全，应加强入境果蔬的检疫查验，预防这类有害生物的传入。2021年7月18日，重庆出入境检验检疫局在对从菲律宾入境旅客携带的红辣椒实施检疫的过程中，截获了一头实蝇幼虫，因为该虫仍处于低龄阶段，难以经过形态学正确判定，因此应用分子生物学方法对其进行判定。
　　1 材料和方法
　　供试样品
　　2021年7月18日在从菲律宾进境旅客携带的红辣椒中截获1头实蝇幼虫，样品储存于75%乙醇中。对照样品为试验室保留的东南亚进境果蔬中常见的辣椒实蝇、橘小实蝇和地中海实蝇样本。
　　形态观察
　　将幼虫样本放在Nikon SMZ800体视显微镜下进行形态特征观察并拍照。
　　基因组DNA提取
　　使用DNeasy Tissue KitQiagen，Germany试剂盒提取DNA。保留于-20 ℃冰箱中。
　　PCR扩增
　　参考文件9，10，采取辣椒实蝇、橘小实蝇和地中海实蝇的特异性引物lati1/lati2、PF-1/PF-2和CCCA-COL-L/CCCA-COL-R生工生物工程上海股份有限企业；PCR反应体系： 10×PCR buffer μL、MgCl22 mmol/L μL、dNTPs mmol/L2 μL、引物各1 μL mmol/L、Taq DNA polymerase U、模板DNA 3 μL、ddH2O μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。取3 μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进