白藜芦醇促进成骨细胞分化机制研究.pdf

山东大学
博士学位论文
白藜芦醇促进成骨细胞分化的机制研究
姓名:周海斌
申请学位级别:博士
专业:遗传学
指导教师:龚瑶琴
20081108
白藜芦醇促进成骨细胞分化的机制研究中文摘要专业:遗传学博士生:周海斌导师:龚瑶琴教授胞和破骨细胞来实现。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,起源于多能骨髓基质中的间质细胞。在成人中,骨髓基质细胞是骨原细胞的来源。骨密度的维持有赖有被磷酸化的稳定地累积增多并进入到细胞核内,通过与转录因子骨骼的生长、发育和代谢过程始终包括骨形成和骨吸收作用,分别由成骨细于成骨细胞和破骨细胞的平衡,而骨质疏松症的发生与成骨细胞和破骨细胞的功能失衡有关,因此骨质疏松症防治的方法就着眼于促进成骨细胞的生长和分化,抑制破骨细胞的形成。白藜芦醇能促进骨髓基质细胞向成骨细胞的分化,以剂量依赖的方式提高碱性磷酸酶和脯氨酰羟化酶活性。其在明显促进成骨细胞分化的同时,能抑制脂肪细胞的分化,目前发现白藜芦醇可以激活6笳哂帜芄灰种浦镜墓丶调控因子。但是目前白藜芦醇促进成骨细胞分化的具体机制尚不清楚。从骨髓基质细胞分化为成骨细胞受到一系列激素和局部因子的调控,其中甤信号通路起着非常重要的作用。蛋白是一类分泌型糖蛋白,调控包括骨在内的很多器官和组织的生长和发育。其功能是与其特异性受体卷曲蛋偷兔芏戎鞍资芴逑喙氐鞍结合,进而激活藕通路,包括经典的甤信号通路。当缺少鞍资保琁梢被虶持续磷酸化,并发生泛素化降解;而当鞍状嬖谑保疞作用,调控下游基因的表达。近年发现,藕磐分械哪承┗的突变导致骨形成异常,例如,功能丧失性突变可以导致骨质疏松,功能山东大学博士学位论文
变,促进间质细胞向成骨细胞的分化。为此,。与人类似,小鼠的缺陷同样会导致骨形成和强,凋亡减少,骨密度明显升高。鉴于甤在成骨调控中的重要作用,对藕磐返母鞲龌方的干预,成为治疗骨质疏松新的药物靶点。如国外研究者成功的利用氯化锂抑制幕钚裕せ頦信号通路的下游分子,抑制的泛素化降解、使其在细胞质内蓄积增多,并进入细胞核内,引起一系列下游相关基因的表达改探讨白藜芦醇促进骨髓间质细胞向成骨细胞分化的分子机制。第一部分白藜芦醇促进小鼠骨髓间质细胞赴虺晒窍赴只骨钙素约俺晒窍赴匾煨宰B家蜃覴做为检测标志,分析了白藜芦醇对赴虺晒窍赴只挠跋欤〉昧艘韵陆峁问呈现剂量依赖效应,高的浓度会对细胞表现出毒性作用。检测成骨细胞特异性转录因子熟的晚期标志物谋泶铩以上研究结果表明白藜芦醇能促进小鼠骨髓间质细胞虺晒窍赴只成骨细胞增殖的下调,而携带获得性功能突变的转基因小鼠的成骨细胞活性增为了明确白藜芦醇促进间质细胞向成骨细胞分化的作用,我们采用成骨条件培养基,和白藜芦醇诱导小鼠骨髓间质细胞系成骨细胞分化。以成骨细胞分化的早期标志物碱性磷酸酶屯砥诒曛疚邹悸ù伎梢悦飨陨逽细胞的钚浴T谂ǘ任到捎糜ü舛縋畉现,邹悸ù即鞸细胞能明显增加虮泶铩捎枚縍甈分析发现,白藜芦醇能明显促进成骨细胞分化成为下一步研究其分子机制奠定了基础。山东大学博士学位论文
白藜芦醇促进成骨细胞分化是通过信号通路介导的导的成骨细胞分化作用的分子机制,本部分围绕藕磐贩治霭邹悸ù即邹悸ù即俳鴓靶基因转录。成骨细胞特异性转录因子虻钠舳影幸桓瞿芄槐籛蛋白第二部分由于疛甧信号通路在骨形成中起重要作用,为了揭示白藜芦醇介进成骨细胞分化的机制,取得了以下结果:邹悸ù寄茉黾覵细胞中总和核。是藕磐分械墓丶肿樱亲B冀岷系鞍譚/墓布活因子。因此,我们首先检测了白藜芦醇处理对赴芰考捌溲细胞分布的影响。发现白藜芦醇处理后,细胞的总量和在细胞核内的分布呈现剂量依赖性的升高,证明白藜芦醇可以使在赴酥欣积。在细胞核内与疞转录因子相互作用调控藕磐返陌基因表达。⑾职邹悸ù,浓度在有效,畉贝锏阶畲笮вΑ=峁得靼邹悸ù伎梢源进含有钠舳咏岷衔坏愕幕蜃B肌邹悸ù级孕∈驲基因启动子区域B家蜃拥挠跋欤激活的转录结合位点,通过对比分析野生型和突变该位点的报告基因,发现白藜芦醇能够通过该基因的启动子骺匚坏愦俳鳵转录。邹悸ù技せ頦信号通路不依赖于。是墓彩芴澹C魅钒邹悸ù即俳晒窍赴只欠裥枰狶与,我们采用方法抑制基因表达,分析了在白藜芦醇促进成骨细胞分化中的作用。首先我们构建了干扰载体,分析发现稳定表达干扰载体的细胞系水平明显降低,成骨相关的部分标志基因表达也有明显的下调。山东大学博士学位论文
总/挥杏跋欤唤鋈绱耍珽眦路的特异性抑制剂芄灰种瓢邹之后我们对比分析了白藜芦醇对稳定表达干扰载体和对照载体细胞的影响,发现白藜芦醇能明显升高两种细胞的幕钚裕幌蛞陨狭街窒赴凶H颈ǜ基因系统也发现,白藜芦醇能增加两种细胞中报告基因的表达。以上结