多菌灵降解菌的降解特性及gfp标记.doc

多菌灵降解菌的降解特性及GFP标记
【摘要】：多菌灵(carbendazim，MBC)，化学名称为N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，是一种高效广谱低毒的内吸性杀菌剂，属于苯胺类苯并咪唑衍生物，其使用X围较广，既可作为工业杀菌剂，又可作为一种有内吸活性的植物杀菌剂，用于水果保鲜、蔬菜、果树和谷类作物的病害防治。多菌灵化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，易致累积效应，其在水体和土壤中的累积会对生态环境和人类健康造成威胁。有研究表明，微生物降解是沉积环境中多菌灵去除的主要途径。因此寻找并研究多菌灵降解菌是十分必要的。XX省农药重点实验室已分离筛选出一株细菌NY97-1，经试验证明该菌具有降解多菌灵的特性，若能进一步研究其降解能力、降解条件，为其在生物修复中的应用提供依据和实验材料，无疑具有重要的理论和现实意义。绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因，被广泛应用于环境微生物学方面，由于其表达稳定，容易观测，因此，可以以GFP作为报告基因，对菌株NY97-1进行GFP标记，为今后研究多菌灵降解菌在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下基础。本文的主要研究内容有如下几个方面：1．该菌株NY97-1的16SrDNA经同源序列比对，同源性为99％以上，结合生理生化指标鉴定其属于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。2．经BamHI酶切的启动子探针载体pUC19-gfp与NY97-1基因组DNA的Sau3AI酶切片段酶连，酶连产物转化E．coliDH5a，建立B．p的启动子基因文库。挑选其中的两个强阳性克隆，亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组的启动子活性片段F4、F5，构建大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pNW33N-GFP4、pNW33N-GFP5。通过电转化得到gfp在B．p中的两株标记菌株。在荧光显微镜下，观察到了明亮的绿色荧光，证明活性片段F4、F5均具有组成型启动子的功能，实现了GFP基因在B．p中组成型表达，且遗传稳定，为今后研究多菌灵降解菌B．p在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下了基础。3．本文研究并建立了多菌灵在降解培养基中的残留检测方法。该方法采用甲醇和水溶液的混合液作提取剂，检测结果表明：该方法的准确度、精密度和灵敏度等指标均符合农药残留分析的基本要求，同以往所报道的方法相比具有样品前处理过程相对简单，回收率高，重复性好，且费用较低等特点，适合于该降解菌的降解能力的检测。4．本文对多菌灵降解菌株NY97-1的降解性能进行了研究。结果表明：该菌株对多菌灵有较强的降解能力。细菌菌株NY97-1在多菌灵浓度为100mg·L~(-1)的条件下，30℃振荡培养24h，％。外界条件对降解菌的降解也有显著影响。培养基初始pH在6～10的X围内均可以高效降解多菌灵，pH为4时，对降解起较大的抑制作用。在多菌灵的浓度为10～300mg·L~(-1)时，菌株NY97-％～％。在35～40℃时对农药降解率最高，经高温高压处理后的菌液对多菌灵仍有降解作用，说明对降解起主要作用的物质耐热性好。共存底物有机氮可以促进菌株NY97-1的降解能力，而无机氮源尿素对菌株NY97-1的降解能力起抑制作用。5．实验证明菌株NY97-1是一株多功能菌株，不仅具有降