多克隆抗体的制备方法.doc

多克隆抗体的制备方法多克隆抗体的概念:由多个 B 淋巴细胞克隆所产生的,受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤:免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀( 剪兔毛用) 一把、弯头眼科手术镊子( 游离血管用) 一把、直头眼科手术剪( 剪血管用) 一把, 手术刀架, 手术刀片, 注射器(1ml 、 10ml , 25ml) 附针头, 兔子固定架, 灭菌三角烧瓶(200ml) 或平皿( 直径 18cm) 、弯头止血钳四把, 直头止血钳两把, 手术缝合线, 塑料放血管,纱布等。二、试剂生理盐水(或 PBS) 弗氏完全佐剂(Freund ’plete adjuvant , FCA) 弗氏不完全佐剂(Freund ’s plete adjuvant , FIA) 二甲苯,酒精棉,脱脂棉, 2% NaN3 三、免疫原:蛋白或 KLH 偶联的多肽。每次免疫 100-200 μg 免疫原。四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上,两耳光滑,明显可见耳静、动脉,健康。五、免疫用生理盐水稀释免疫原,然后与相应的佐剂进行 1:1 混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂, 将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用 1/4 的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。注: 抗原注射以前需要收集一些正常血清,已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定,大概需要四天左右时间,可以进行耳动脉取血。取血量约 5ml 足矣。免疫用的抗原必须纯化, 否则影响抗体的质量。抗原经 FCA 或 FIA 充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后, 置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化, 乳化过程比较费时、费力,但若乳化不充分,会影响免疫的效果,振荡后, 1000rpm 离心一分钟, 如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用 FCA ,以后都用 FIA 。免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选 4-6 点皮下注射, 每点注 , 间隔 2 周后再于上述部位选不同点注射( 不要选择临近位点, 否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约 100 μg 。免疫次数在四五次即可,抗原用量大可以减少次数。六、取血: 免疫一周后,可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低, 头两次取血, 够检测用即可。在三次免疫后, 可以获得较高效价的抗体, 每次取血量可以在 40ml ,不要取太多,否则会造成兔子贫血。前几次取血用 19 号针头对兔子进行耳动脉取血,室温过夜析出血清。最后一次取血可以采用颈动脉放血,具体操作如下: 1、家兔仰卧于兔架上固定头部, 用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。 2 、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约 10cm ,分离皮下结缔组织,直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌( 小心操作,如碰到小血管出血,可用止血钳止血)。 3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织, 暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离,剥离神经和结缔组织。 4、于动脉下套入两根黑丝线, 分别置于