人HSP70D的表达纯化及其免疫佐剂样效应研究硕士论文.pdf

英文缩略词
热休克蛋白
重组人
变性的重组人
抗原提呈细胞
主要组织相容性复合物
细胞毒性细胞
自然杀伤细胞
单克隆抗体
聚合酶链式反应
磷酸盐缓冲液
聚丙烯酞氨凝胶电泳
反转录
白细胞介素一
正干扰素
粒细胞巨噬细胞
集落刺激因子
阴孔
肿瘤坏死因子
叮
异丙基硫代一半乳糖昔
口从气
卵清蛋白
口
树突状细胞
人的表达纯化及其免疫佐剂样效应研究
中文摘要
硕士研究生常卫红
导师曹雪涛教授
第二军医大学免疫研究所
热休克蛋白的佐剂样效应以及在抗肿瘤及抗感染
免疫中的应用,一直是研究领域的热点,作为热休克蛋白家族的重要成
员,有大量的报道和研究证实,从肿瘤组织中分离的在动物体内能诱导出明
显的肿瘤特异性,对随后接种肿瘤细胞具有抵抗作用。采用一抗原肤复合
物作为疫苗诱导抗肿瘤抗感染免疫己经进入临床试验阶段并显示了良好的应用前
景。但作为个性化的治疗模式,该方案难以产业化,因此体外表达分子,然
后与抗原肤交联,可能成为一种新型疫苗和新的治疗模式,在本研究中,我们采用
原核表达系统,对人分子进行大规模的表达纯化,旨在建立一种新的
纯化的方式,研究所纯化的人的佐剂样效应,并将其应用于肿瘤的免疫治疗。
首先,根据人序列设计一对包含全长编码区的引
物。其中上游引物为包含起始
码端包含酶切位点,下游引物为
不包含终止码端含位点。预期通过
双酶切连接到原核表达载体。随后,我们采用反转录聚合酶链式反应
方法,从人宫颈上皮癌细胞系细胞中克隆了人全长编码
区序列。采用试剂提取人宫颈上皮癌细胞系细胞总,并利
用反转录酶活性将细胞总反转录为。以人引
物进行阳性对照扩增,得到的预期片段后,采用上、下游引物进行
扩增,扩增参数为秒,秒,分钟,循环后延伸
分钟。经琼脂糖凝胶电泳分析显示,通过从经细胞中克
隆到了相当于预期大小的单一特异性条带。产物经纯化后进行
酶切,酶切产物经胶回收后与酶切的载体连接,转化
大肠杆菌。挑取克隆进行纯化并经酶切鉴定。电泳结果显示,阳
性插入克隆可以得到一条约的插入片段条带以及一条约的载体条
带。最后阳性插入克隆以通用引物引物和引物,以及
条的基因特异性引物进行序列测定,序列正确的阳性质粒重新转化
至感受态细菌一,经酶切鉴定阳
性克隆后,重组子记为,用于随后进行的蛋白表达和纯化
以及功能研究。
为了获得足够数量及符合临床试验要求的重组人,我们在前一部分实验
完成了基因工程人的高表达菌种的构建及筛选的基础上,对其发酵表达条
件及纯化条件进行优化,确定最佳的条件和方法,建立稳定、可靠的生产工艺。
首先通过摇床发酵实验我们观察了不同的培养基包括
培养基对工程菌生长及重组蛋白表达量的影响。结果表明,工程菌
在培养基中细菌生长较快,但当生长至一定密度后细菌的生长出现停滞。
而在培养基中细菌生长速度稍慢,但由于培养基具有很好的缓冲能力,因此
可获较高的生长密度。在低密度生长时,加入诱导后工程菌在各培养基中的
表达量无显著差异。在发酵罐发酵实验中,我们对工程菌的在发酵罐中
的生长曲线进行了研究,并选择了最适的细菌生长密度。结果表明,经过小时培
养后,细菌的值可达以上,此时加入诱导后,目的蛋白
诱导表达水平最高,可达细菌总蛋白的以上,较摇床发酵实验表达量有明显的
提高。
本工程菌采用的载体以作为启动子,它受表达的阻蛋白的抑
制。由于的存在限制了外源基因的持续、高水平的表达,对宿主菌起到稳定作
用。但诱导剂可以消除表达阻遏蛋白对外源基因表达抑制。不同浓度
加入后,对目的蛋白的表达会产生一定的影响。一般地,采用可诱
导多种目的蛋白的表达,在一定范围内,的浓度与表达产物的产量成正比,但
过高的浓度,由于蛋白质表达量增加,影响蛋白质的正确折叠,从而使一部
分原来以可溶性表达的目的蛋白转变为包涵体形式存在,从而对后续的纯化和制备
过程产生影响
通过小量发酵实验,我们探讨了不同浓度对表达量的影响,并
观察了不同诱导时间后的表达量。结果表明浓度在范围
内,的表达量随着加入诱导剂浓度的增加而增加,且可溶性的
比例无明显变化。加入诱导后,即可见明显的表达,在
小时内表达量随诱导时间的延长而增加。
由于重组表达的以可溶性蛋白形式存在于细菌胞浆内,因此在纯化
初期我们对细菌破菌后上清进行了预处理,通过乙醇沉淀条件的优化,选择含
氯化钙、氯化镁及乙醇对上清进行沉淀,使样品的粘度下降,纯度提高。
随后我们对样品进行阴离子交换柱层析,通过溶液的值、离
子