可行性报告-融合技术筛选林可霉素可行性研究报告.doc

最新融合技术筛选林可霉素可行性研究报告
一、总论
项目的主要内容及技术原理简述
主要内容：
本研究基于以林可霉素产生菌林可链霉菌(StreptomycesLinloinensis)为出发菌株，采用加热、紫外线(UV)、DES三重复合诱变处理，用终点产物林可霉素为选择压力进行梯度筛选，经摇瓶初筛、复筛获得较高效价菌株，最后用正交设计来优化发酵培养基。本研究采用三种不同的诱变方法分步处理林可霉素产生菌，促使林可霉素产生菌的DNA多基因位点发生突变，然后采用耐自身终产物和前体物压力梯度筛选方法把高产林可霉素产生菌筛选出来。利用菌种的自然突变，多因素低剂量的诱变效应来筛选稳定生产林可霉素的突变株作为亲本与三重复合诱变筛选的高产菌株进行原生质体融合，促使两亲本优良性状的基因重组从而获得高产稳定的融合菌株。把三重复合诱变技术和原生质体融合技术结合筛选林可霉素高产稳定菌株。
本项目完成时筛选到高产稳定融合菌株，50立升发酵罐林可霉素发酵单位达到7000u/ml，优化高产稳定菌株的罐上发酵工艺用于生产林可霉素。
技术原理：
自然分离的机理：多因素低剂量的诱变效应，互变异构效应（据统计，碱基对发生自然突变的几率约为10-8~10-9)造成的结果：一部份菌种退化，也有少部分高产菌，对生产有益，简单易行，纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量。
三重复合诱变的机理
染色体畸变：染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。
基因突变：DNA中的碱基发生变化，即点突变。
诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素有物理的、化学的和生物的三大类。
三重复合诱变的特点：第一，诱变效率较高，即产生点突变的频率相对较高，而染色体畸变相对较少，并且诱变范围广。因而可被用来对微生物的某一特殊性状进行改良，并且容易出现高产的突变体。第二，出现的突变体类型较多。尽管主要引起的是G•C－A•T碱基对之间的转换，同时也由于两种不同的诱变方式结合，使得突变位点增加，突变方式多样。在突变过程中可出现其它各种类型的突变体，因而具有多效性。第三，与其它诱变方法相比，三重诱变后产生的显性突变体相对较多，因而易于筛选突变体。

把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。
两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。
获得高产优质菌株经过原生质体化与再生过程，可能得到产量提高的细菌和链霉菌的变异菌株；种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。

菌株的基因发生改变，随之其代谢途径也会发生改变。因此，有必要通过正交实验，来探索主要的C源（葡萄糖、淀粉）和N源（硫酸铵、黄豆饼粉）对林可霉素产生菌代谢的影响，从而找出诱变后的高产菌的最优培养基配方。
项目的目的和意义
林可霉素(LincomycinLC)又称洁霉素，是一种高效广谱抗生素，于19GG由美国人Mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得，从此获得广泛应用。
林可霉素对革兰氏阳性菌有较强的抑菌作用，特别是对链球菌、金黄色葡萄球菌及厌氧菌的抗菌作用尤为明显，在许多感染症的治疗中疗效显著。由于其对组织和细胞的穿透力强，应用方便，不需做皮试，临床上用于肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌及金黄色葡萄球菌的感染。特别用于严重厌气菌引起的感染及金黄色葡萄球菌骨髓炎。而且林可霉素用药途径较多，副反应
较少，控制感染快，是较有前途的一种抗生素。
利用菌种改良技术提高抗生素的产量、质量是增加抗生素生产效益的最有效途径，基因工程菌的构建是当今育种技术发展的热点，但由于很多抗生素合成相关基因及其功能尚未掌握，且已构建的工程菌经常发生性状丢失，所以基因技术应用受到极大限制。传统育种方法，盲目性大、实效差，在2O世纪7O年代发展起来的杂交育种方法受到遗传标记的限制，应用较少。虽然皖北药业股份有限公司利用先进的基因工程技术对林可霉素菌种进行改良、筛选出高产优质的林可霉素产生菌，摇瓶效价达到4500μ/ml以上。应用于生产后，使发酵单位提高到6000μ/ml以上，同比增长40%。但是偏低的状况。目前，利用离子注入技术对抗生素产生菌诱变处理国内已有一些报道[16],氮离子注入技术用于林可霉素产生菌的诱变,取得了一定的效果。
本实验通过三重诱变（热诱变－UV－DES）处理林可霉素生产菌及抗终点代谢物突变株的筛选，以期能提高其产林可霉素的能力，且利用正交设计来优化经过三重