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染色第5章研究微生物的基本方法随着现代医学及相关科学技术的发展, 各学科相互交叉和渗透, 医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平,许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术, 准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物, 并对引起感染的微生物进行耐药性监测, 为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。第一节显微镜观察由于细菌个体微小, 肉眼不能看到, 必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构可用光学显微镜观察, 其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有如下几种。 1 .普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源,其波长约为 μm 。显微镜的分辨率为波长的二分之一,即 μm, 而肉眼可见的最小形象为 。故用油(浸) 镜放大1 000倍,能将 μm 的微粒放大成肉眼可见的 。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。 2 .暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后, 光线不能从中间直接透入, 视野呈暗色, 当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射, 因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。 3 .相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用,改变直射光的光位相和振幅,将光相的差异转换为光强度差。在相差显微镜下, 当光线透过不染色标本时, 由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异, 可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。 4 .荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同, 主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数使用的是落射光装置, 常用高压汞灯作为光源, 可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外,也可用暗视野聚光器, 以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。 5 .电子显微镜用电子流作为光源, 波长与可见光相比差几万倍, 大大提高了分辨力, 并用磁性电圈作为光学放大系统,放大倍数可达数万倍或几十万倍, 常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。 制片和染色一. 非染色标本非染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明, 在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼, 无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式, 具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。 1 .悬滴法在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林, 用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央, 再将凹玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上, 然后迅速翻转, 轻压盖玻片, 使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下(或暗视野)观察。 2 .压滴法用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央, 在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片, 注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢, 静止数秒钟后置高倍镜下明视野(或暗视野)观察。 3 .毛细管法主要用于厌养菌动力的检查。通常选用 60~70mm 长。 ~ 孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后, 用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管