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质粒抽提所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点:如何去除 RNA ,如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开,如何去除蛋白质及其它杂质。【如何去除 RNA 】去除 RNA 相对比较简单,首先是使用 RNase 消化( 抽提中或者抽提后) 。经过 RNase 消化后, RNA 变得比较小了,其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得 RNA ,则需要更烦琐的操作。【如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开】基本上是采用两种办法: 一是利用酶/ 弱去污剂部分裂解细菌, 在抽提时只让质粒从细菌中释放出来, 而不让基因组 DNA 从细菌中出来, 从而将质粒和基因组 DNA 分开; 二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌, 让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来, 再利用质粒和基因组 DNA 在变性/ 复性过程中的不同表现,将质粒与基因组 DNA 分开。【去除蛋白质及其它杂质】基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是,依据不同的细菌,不同的培养条件,以及操作时的精细程度等,杂质的残留量会不同。所以, 通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。经过上面的处理,沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验,如转染,则需要做进一步的纯化,如 CsCl 超离心。【实验前方法/ 试剂的选择】首选方法是碱裂解法。如果有问题,或者是大质粒(>15 kb) ,则用温和的方法 SDS 裂解法。详细情况见“分子克隆”。试剂盒几乎都使用碱裂解法,所以都有一个通病,抽提大质粒时效果不好。【关于碱裂解法】质粒抽提最常用的方法是碱裂解法, 它具有得率高, 适用面广, 快速, 纯度高等特点。关于碱裂解法的原理,复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专论,大家可以去看一下。这是一篇美文,非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点,也是非常有启发的。当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性;不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长, 这种变性就成为不可逆的了( 电泳时在超螺旋前面一点点, 如果有一条带, 就是此变性的质粒。)。所以, 要降低不可逆的变性, 就要控制好碱裂解的时间。( 似乎可以做这么一个推理:在碱性条件下,质粒的两条链从一点或者几个点开始分开,随着时间的延长,直到完全分开。理论上讲,完全分开的两条链要很快地配对复性, 成功率肯定不可能是 100% 的, 而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性。) 碱裂解法不适合大质粒的抽提,原因也是因为该方法太剧烈,使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法,缺点是得率要低一些。现在得问题是, 大质粒的拷贝数本来就低,如果抽提方法得率再不高的话,抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中,超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低,随着粘稠度的增加而减低这个现象,完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的: 增加试剂的使用量, 使加入 NaOH/SDS 液后, 溶液在 1 分钟内就能变得很清澈; 立即加入中和试剂。这个实验我们没有做过,但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。【质粒抽提的 8 大窍门】 1 :摇菌时间- 过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况。如果出现了问题, 调整培养时间会有帮助: Nick 多, 则增加培养时间; 酶切出现问