凝血酶对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡作用研究.pdf

泸纠压学院研究生硕士学位论文凝血酶对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡作用的研究迥晡逶二中图分类号:
凝瓶酶对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡作用的研究摘要胞¨亩拘宰饔眉凹佑媚C柑匾煨砸种萍林刈樗嗡睾蟮南赴目的:本实验通过研究凝血酶对体外培养的原代大鼠脑微血管内皮细态及其生化特征、遗传物质性状的变化,来证实凝血酶对大鼠脑微血管内皮细胞存在凋亡作用。同时观察胞内游离钙离子浓度的变化来探讨内皮细胞凋亡的分子机制。而探讨凝血酶的预适应现象进一步揭示凝血酶在血脑屏障损伤中的地位和作用。方法:取新生大鼠脑组织,剥离硬脑膜,经过匀浆、过滤分离脑微血管段,%型胶原酶消化后进行原代培养。玪后待有多量内皮细胞从贴壁的微血管段中长出,用含%胎牛血清的培养基培养,以后每灰阂淮巍>翁Ъ俺9嬉蜃英喙乜乖疫细胞化学方法鉴定为脑微血管内皮细胞后,传代培养并进行实验。取第赴×痗的细胞密度种于预先放有细胞爬片的孔培养板,每组住J笛榉治6哉兆椤⒉煌亮磕C缸椤⒛C水蛭素组、预适应组。对照组在培养孔中加入含%胎牛血清的培养基。不同剂量凝血酶组设雠ǘ龋直鹞/、/和/。凝血酶水蛭素组为先加入/凝血酶于嘌校⑹固ヅQG逯张度为%,孵育小时后,再加入/水蛭素。预适应组先加痬凝血酶于嘌校⑹固ヅQG逯张ǘ任猯ィ跤∈焙螅再加入/凝血酶。以上各组的胎牛血清终浓度均为%。孵育小时后检测。通过测定脑微血管内皮细胞在体外对不同剂量凝血酶及凝血酶特异性抑制剂水蛭素处理的反应,同时观察预适应处理时的反应,来研,
究凝血酶对脑微血管内皮细胞的毒性作用。实验中使用倒置相差显微镜观电镜技术观察到ㄋ酰旧试诤酥鼙吣杉怂榱选⒖察细胞形态变化;使用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化;使用细胞免疫组织化学结合分子生物学方法荒┒送蜒鹾烁仕嶙R泼附榈糳缺口末端标记囱芯肯赴糯镏蔇对凝血酶毒性的反应;并用%琼脂糖凝胶电泳技术研究细胞内狭训确肿由镅形5母谋洹J褂荧光标记技术结合流式细胞仪来观察细胞内钙离子浓度的变化,即用钙离子荧光探针/细涸睾螅舛的胞内钙离子浓度来探讨凝血酶毒性作用的分子机制。结果:嘌哪晕⒀9芏斡~天后长出多量梭形细胞,胞核居中,成“铺路石”样外观。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化分析和细胞形态分析,鉴定为脑微血管内皮细胞。经传代培养后,细胞形态无明显变化。玫怪孟嗖钕晕⒕翟谛翁现な担低剂量凝血酶可以促使脑微血管内皮细胞收缩,而高剂量凝血酶处理后,脑微血管内皮细胞数量减少,形态不规则,呈现明显的凋亡相。使用透射泡和凋亡小体形成等超微结构的细胞凋亡形态学改变从薅证实了凋亡细胞的存在。用原位末端脱氧核甘酸转移酶介导缺口末端标记免疫组化方法显示,/和/组的细胞凋亡率分别为%、..±%,与对照组相比,尴灾圆钜欤挥痬凝血酶组相比,。而/凝血酶嗡刈樘葑刺醮幻飨浴细胞内钙离子浓度随时间不同有明显动’
态变化,且凝血酶特异性抑制剂水蛭素可以完全阻断凝血酶的这种作用。./U庖还逃氲蛲龉叹哂惺奔渖系囊恢滦浴DC水蛭素钙离子荧光探针/涸睾螅褂昧魇较赴羌觳庀赴诟评胱优度,/凝血酶组脑微血管内皮细胞内钙离子浓度静息时为±./痬C阜跤∈焙罂J忌仙±./∈贝±./∈焙蟠锏礁叻±./缓蠡郝陆担∈焙笕晕椿指粗琳K±,,免疫组化方法证明,该组蛲雎式鑫.±%,。流式细胞仪检测表明,预适应组脑微血管内皮细胞内钙离子浓度在、、、系ゴ磕C缸/陆担冉喜钜煊邢灾。结论:〖亮磕C复偈鼓晕⒀9苣谄は赴账酰蠹亮磕C复使脑微血管内皮细胞凋亡,导致血脑屏障的损伤。C柑匾煨砸种剂水蛭素可以完全阻断评胱拥脑黾印6赴诟评胱优ǘ日;后,牡蛲雒飨约跎伲得飨赴诟评胱又辽俨糠值夭斡肓四C的促凋亡作用。〖亮磕C付訠有预适应现象。综合以上结果,可以看出,凝血酶参与了蛲龉蹋又匮D云琳系钠苹担起脑水肿的发生。早期应用其特异性抑制剂水蛭素,可减轻蛲觯保护血脑屏障。重组水蛭素治疗有可能成为防治脑血管疾病的有效措施之,
一。凝血酶的预适应现象可为临床进行脑保护治疗寻找新的途径。关键词:脑微血管内皮细胞;细胞培养;凝血酶;凋亡;水蛭素
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经元及神经胶质纽胞的损伤作用已经在体内、外动物实验中得到证实晦¨叼。脑疾病时血脑屏障破坏,血浆中的水、血浆蛋白、蛋白酶、炎症细胞及炎症介质渗出,形成脑水肿和脑损伤。而血脑屏障由微血管