放线菌素dtnf-α诱导小鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡研究.pdf

南方医科大学
硕士学位论文
放线菌素D/TNF-α诱导小鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡的研究
姓名:湛奕
申请学位级别:硕士
专业:内分泌与代谢病学
指导教师:蔡德鸿
20090526
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:湛奕指导教师:蔡德鸿教授摘要研究背景但长期处于一种慢性的低度亚临床炎症状态的吞悄虿』颊撸绕浞⑸V此,深入研究胰岛内皮细胞病理生理改变的机制,建立有效阻断损伤通路的途低度炎症性疾病。炎症已成为的一种重要发病机制,炎症与之间的关系已成为近十年来国际研究的一个热点。大量证据表明,〉牟±砩砉讨校咀橹姆置诠δ芪陕野缪萘酥匾=,也是脂肪源硕士学位论文胰岛是高度血管化的微器官,胰岛微血管内皮细胞琁是胰岛微血管的主要组成部分,不仅具有血管内皮细胞的一般性质,如血管生成、止血的作用,而且担负着营养赴⒎置谟盏胰岛细胞生长发育信号分子的功能。既往已有研究证明,赴δ芩ソ吆芸赡是胰岛微血管病变的表现【,而过量的凋亡是引起胰岛微血管病变的重要因素。正常的情况下,血管内皮细胞的凋亡与生成处于一个动态平衡的状态,酸中毒、急性感染时,短时间内启动炎症级联反应,导致胰岛微血管内皮细胞大量凋亡,从而破坏动态平衡,抑制了血管的生成,最终导致赴鹕恕>径,对于保护胰岛细胞,阻止糖尿病的发生发展具有积极意义。近年来炎症病因学理论倍受关注。该理论认为,,被认为是参与胰岛素抵抗,⒆钪导致吞悄虿》⑸闹匾R蛩亍
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目的方法甉是具有广泛生物学活性的细胞因子。甉可直接或间接诱导细胞凋亡,通常认为【的细胞学效应主要由榈肌能激活凋亡通路,导致细胞凋亡。血管内皮细胞表面存在產受体,故血管内皮细胞也是作用的靶细胞。在原代培养的牛血管内皮细胞中加入產,出现大量的细胞凋亡,并存在剂量和时间效应关系。在这种慢性低度炎症状态之下,有微血管病变的吞悄虿』颊叱鱿盅9苣谄は赴蛲龅南窒笥胙G逯写嬖诟吲ǘ的表达和阻断凋亡通路的机制,本试验在建立小鼠凋亡模型的基础上,以小鼠为研究对象,探讨炎症因子与胰岛微血管内皮细胞凋亡的关系,/碳ざ訧淖饔眉捌淇赡艿乃鹕嘶疲⑿∈驣牡蛲模型,为干预糖尿病及寻找新的治疗靶点提供实验依据。悦拦⑾赴中文摘要置芮邢喙亍D谄は赴乃鹕擞执偈笽和甉的释放,再次加重血管内皮细胞的损伤,两者互为因果,形成恶性循环。’此外,有学者发现甉可通过死亡受体、氧化应激等途径导致胰岛赴蛲觥S醒芯糠⑾。随后缺ǖ溃琓可通过线粒体途径激活嬲、,产生同样的生物学效应。以上研究结果说明產可通过多种途径导致内皮细胞与细胞的损伤与凋亡。许多实验显示,加用铣梢种萍练畔呔谼或蛋白质合成抑制剂放线菌酮,可使原来对產细胞毒作用不敏感的细胞出现凋亡,或使对產敏感的细胞出现更强的凋亡效应。为了更好地观测炎症起始细胞因子產、。研究肿瘤坏死因子褪芴在小鼠上的表达,观察冢,细珹Ⅱ
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胞作为试验对象进行培养和诱导凋亡。%新生牛血清的高糖加二抗即标记羊抗兔椅路跤7馄笤谟ü庀晕⒕迪鹿鄄臁⑴恼铡干涞缇倒鄄欤航赴婊治组:①正常对照组、②產组./,以下括号内浓度均指终浓度ⅱ跘疶—毛痬赴臼笛榉治A讲糠郑航赴又钟装逯校靠,在℃、,吸除培养基,每孔加入甲亚枫振荡≡波长测吸光度以判断细胞活力。同时,设不加细胞只加培养液的空白对照孔,比甉体外对生长的细胞毒性作用用不同浓度的甉作用于对.⒐鄄炱涠訫生长的影响。实验分组:用ḿ觳釧瓺瓹对/甉的拮抗作用。实验分组:为正常对照组,细胞未经任何处理;槲=;槲狝硕士学位论文培养基中,、饱和湿度下培养。细胞贴壁生长,铺满后以胰酶消化传代,每传代巍赴榔懊庖哂ü馊旧ǎ合赴螅煤%新生牛血清的培养基将细胞调成的细胞悬液,接种于装逯校赴ぷ刺己檬敝罩古嘌%多聚甲醛固定爬片驪冲洗,用处理后以正常羊血清工作液封闭,倾去血清,滴加一抗即兔抗鼠嗫寺】固澹购蟮终浓度为预处理后再加入產O赴┪镒饔后,再用胰酶消化、吹印⒗胄摹⑵锨搴笠%、的戊二醛固定,双铅染色后置透射电镜下观察细胞的形态学变化。培养箱中培养孔个复孔。用不同浓度的產靠譨、孵箱中刺激小时后,每孔加芤/,,孵育色时以空白孔调零。.,,,痬;/甉组在/预处理后加入与上组相对应的浓度的產;作用时后,用ḿ觳庀赴咀饔茫..
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结果/后入/產,孵育螅肕法检测细胞毒作/.、.、.、.。结果显示/產于不同浓度的/產组痬/;槲<尤階狣狢用。魇较赴羌觳