测定多糖的方法.doc

测定多糖的方法: 蒽酮—硫酸法, 苯酚—硫酸法, 比色定量法, 纸色谱法, 离子交换色谱法, 酶法,原子吸收法, HPLC 法, DNS (还原法) ,磷钼比色法。一、苯酚—硫酸法 1、原理: 糖在浓硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。在 10~ 100mg 范围内其颜色与糖的含量成正比。在 485nm 波长下有最大吸收峰,故可用比色法在波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖和多糖的测定方法。简单, 灵敏度高,实验室基本不受蛋白住存在的干扰。 2、实验药品浓硫酸苯酚 3 苯酚溶液的配制(1) 先配制 80% 苯酚溶液,然后称取 苯酚加 水,使之溶解,置于冰箱中, 避光长期保存。取 80% 苯酚 定容到 500 Ml. 配制成 60% 的苯酚溶液, 避光保存。(2) 取苯酚 100g ,加铝片 和碳酸氢钠 ,蒸馏收集 182 ℃馏分。称取 加水 150mL 溶解,置棕色瓶内放冰箱备用。二、蒽酮—硫酸显色法 1、实验药品蒽酮硫酸 2、溶液的配制称取蒽酮 ,加浓硫酸 100mL 混均即可(现用现配) 三、高效液相色谱法多糖溶液进行高效液相色谱,利用 TSK — GEL G4000PW — 10A 示差折光检测器,以双蒸馏水为流动相,溶液浓度为 / Ml, 进样量 50μL ,根据峰形判断样品的纯度。四、 DNS 法为排除还原性单糖的干扰,可采用 DNS ( 3,5 —二硝基水杨酸)比色法测定还原糖的含量。 1、原理在碱性溶液中 3,5 —二硝基水杨酸与还原性糖共热后被还原成棕红色氨基化合物, 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。再将通过硫酸—苯酚, 或者蒽酮—硫酸法得到的总糖结果减去还原糖,即得较准确的多糖含量。五、地衣酚—硫酸法溶液的配制称取 400mg 地衣酚( 3,5—二羟基甲苯)溶于 155mL 浓盐酸中,另加 45mL 含 % 三氯化铁的 · mL _1 盐酸,临用前配制。苯酚—硫酸法和蒽酮—硫酸法的缺陷: 首先葡萄糖是单糖而植物多糖的组成是多样的, 只是用葡萄糖作为参照不确切, 其次, 显色试剂的不专属单糖的干扰严重, 实际上测得的结果是总糖的结果。 33。5 一二硝基水杨酸法( 简称 DNS 法) DNS 法测定原理基于在一定的范围内,还原糖的含量和反应液颜色成比例关系,利用比色法可测定多糖的含量。对没有还原性的多糖, 可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行定。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物, 3, 5- 二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3 一氨基一 5 一硝基水杨酸。在一定范围内, 还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在 540nm 波长下测定吸光度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时, 每断裂一个糖苷键需加入一分子水, 所以在计算多糖含量时应乘以 。 DNS 比色法中, 色素等还原性物质可与 DNS 显色剂显色, 采用水解前测定值校正水解后测定值的方法简便、有效地排除了色素等杂质的干扰。 DNS 法测多糖含量具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点。 4 萨氏(Somogyi —