肌酐酶纯化、性质研究及血清肌酐酶法分析初步建立.pdf

中国和医科大学硕士学位论文
肌配酶纯化、性质研究及肌醉
酶法分析的初步建立
摘要
目的对肌酶产酶菌株的培养,产酶条件,
酶的纯化及酶学性质作较为全面的研究。同时对肌酶法分析
的建立进行了初步的探讨和研究。一方法本实验中肌醉酶法分
析所采用的酶偶联反应为四步,最后检测在处吸
光度的变化来计算出肌水平其中涉及四种酶肌醉酶,肌
酸激酶, 丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶。肌酸激酶和丙酮酸激酶由
合作的实验室从兔肌中提取。乳酸脱氢酶的性质研究已由前人
完成。肌醉酶的获取和肌醉酶法分析的建立是本论文的一个重
点。发酵菌株来源于本实验室筛选的细菌
在发酵培养基中小时培养后, 与玻璃砂混合在细菌破
碎仪破碎,再分别进行硫酸按沉淀, 分
子筛层析及离子交换层析等步骤纯化。在紫外
分光光度仪上进行肌酶法分析的研究。探索了酶偶联系统的
最适缓冲液及最适值,反应体系中各工具酶的最适浓度,

并对建立的方法进行了初步的评价。结果分子筛凝胶法测得
肌醉酶的分子量为以肌酸为底物时的值为
最适值为最适反应温度为肌醉酶在
以下较为稳定的琉基乙醇和的甘油对该酶有很好的
保护作用。在酶偶联反应体系中,选择的甘
氦酸作为缓冲液肌醉酶,肌酸激酶,丙酮酸激酶和乳酸脱氢
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酶的最适反应浓度分别为以
分析纯的肌醉配制成标准液,在紫外分光光度仪上手工测定表
明该酶法在肌醉浓度范围内有很好的线性关系,
与苦味酸法的对比实验结果也表明二者有很好的相关性。
关键词肌醉肌醉酶酶法分析
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舌
血清肌配水平的测定对肾脏功能的损伤有重要的诊断意
义。口前临床实验室最常用的测定肌醉的方法是碱性苦味酸法,
即反应。反应最大的缺点是特异性不高。一些肌醉的
同系物或衍生物如乙酸乙酸,丙酮酸,乙内酞脉等物质均能和
苦味酸发生反应。这些物质称为“假肌醉”,可导致肌醉测定结
果的假性升高。用纯化的工具酶来建立一个酶偶联反映体系,
使待测物质通过一系列反应产生我们能够检测的信号如吸光
度的变化,从而对待测物质进行定量。由于酶的高度专一胜
酶分析方法能够大大提高测定的特异性。本研究的目的就是建
立一种用于测定肌酚水平的酶分析方法,我们使用的酶偶联反
应体系为
肌配肌酸
肌酸十磷酸肌酸
磷酸烯醇式丙酮酸十丙酮酸十
丙酮酸升乳酸
随着反应的进行, 转变为在处吸光度逐
渐降低,其降低的速率与叭配量成正比
反应体系涉及四种工具酶肌醉酶,肌酸激酶, 丙酮酸激
酶和乳酸脱氢酶。肌酸激酶和丙酮酸激酶由合作实验室从兔肌
中提取,乳酸脱氢酶的性质研究己由本实验室的其他人完成。
木论文的重点是肌醉酶的纯化,性质研究及肌醉酶法分析的初
步建立。全文主要分三部分肌醉酶的纯化及性质研究乳
酸脱氢酶的纯化肌醉酶法分析的初步建立。
第一部分肌酥酶纯化及其性质研究
实验材料
一主要试剂
肌醉一
肌酸一
酵母提取物
麦芽提取物
苦味酸广东台山化工厂
硫酸按北京化工厂
聚乙二醇上海化学试剂分装厂日本进日
一一

一

凝胶过滤分子量标准蛋白
仪器
冷冻离心机
紫外分光光度仪型
恒温水浴箱
细菌破碎仪
恒温摇床
层析柱
层析柜
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硕士学位沦文
紫外监测仪,记录仪
蠕动泵
梯度混合仪
自动收集器
真空泵,干燥器国产
三缓冲液
,磷酸盐缓冲液
磷酸盐缓冲液
四培养基
限制性培养基

臼


种子培养基

比


发酵培养基




菌种
自己实验室筛选保存的菌株
实验方法和结果
一肌醉酶的活性测定
反应方程式
肌酸一一肌
肌醉苦味酸桔红色染料
试剂
肌酸溶液溶解
溶液
苦味酸溶液
步骤
①取试剂至试管中,℃放置分钟。
②加入酶液,混匀,在反应分钟。
③迅速移取反应液至中。
④加入苦味酸,在℃放置分钟。
⑤在处测值。
⑥把酶液加入冰浴的中,混匀后取
至中,重复步骤,测得空白对照的值。
活计算

酶活