再生障碍性贫血患者骨髓cd4t细胞致病相关基因筛选研究.pdf

华中科技大学
博士学位论文
再生障碍性贫血患者骨髓CD4<'+>T细胞致病相关基因的筛选研
究
姓名:郑邈
申请学位级别:博士
专业:内科学(血液病)
指导教师:刘文励
20070426
华中科技大学博士学位论文
再生障碍性贫血患者骨髓细胞致病相关基因的筛选研究

华中科技大学同济医学院附属同济医院血液内科
博士学位申请人:郑邈
博士研究生导师:刘文励教授

中文摘要

第一部分
再障患者和健康人骨髓细胞增殖能力、凋亡特性及其分泌的细胞
因子对脐血造血干祖细胞影响的比较研究

目的:从细胞增殖能力、凋亡特性及其分泌的细胞因子对造血干祖细胞的影响几方
+
面,全面评估再障患者骨髓细胞的生物学特性,为临床揭示再生障碍性贫血(再
障)发生的免疫机制提供新线索。
+
方法:采用免疫磁珠分选法从再障患者和健康人群骨髓中分离出细胞,用改良
+ +
法检测两者骨髓细胞的增殖能力;用高浓度单抗诱导细胞凋亡,
+ +
比较再障患者和健康人群骨髓细胞凋亡特性的差异;以两者骨髓细胞培
+ +
养上清作用于脐血来源的造血干祖细胞,观察脐血造血干祖细胞
的形成,关键亚型( ) 及蛋白的表达水平。
+
结果:与健康人相比,再障患者的骨髓细胞显示出明显更强的增殖能力。高浓
度单抗作用后,电镜下可见正常组和再障组均有细胞凋亡,但再障患者较正
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常人更多。与电镜结果一致, 流式细胞仪检测凋亡率发现再障患者早
期凋亡和晚期凋亡的细胞均较正常人多。早期凋亡率正常组±,再障组
±;晚期凋亡率正常组±,再障组±。以骨
+ +
髓细胞培养上清作用于脐血来源的造血干祖细胞,倒置显微镜下观察结
果,再障组为:( ±) 个细胞;正常组为: ±
个细胞,两组比较有显著性差异。和分析显示,再
+ +
障患者骨髓细胞培养上清能从和蛋白水平抑制脐血造血干祖细胞
的表达。
结论:再障患者骨髓+ 细胞在体内可能处于异常增殖、活化的状态,并且可能与
+
再障患者骨髓的造血功能衰竭密切相关;再障患者骨髓细胞可分泌某些可溶性
的细胞因子,通过抑制造血干祖细胞的表达,从而抑制其增殖,引起造
血衰竭。
关键词:再生障碍性贫血; 细胞;增殖;凋亡;细胞因子

第二部分
再生障碍性贫血患者骨髓+ 细胞抑制消减杂交文库的建立

目的:分析比较再障患者与正常人骨髓细胞的基因组变化,以期获得与再障患
者骨髓细胞功能改变有关的基因。
方法:从再障患者和健康供髓者骨髓中分离出细胞,以健康供髓者骨髓
细胞作为“”,以再障患者骨髓细胞作为“”,筛选再障患者骨髓
细胞中差异表达的基因,建立抑制消减杂交文库。
结果:我们提取的细胞总进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳显示清晰的、、
三条带,提示所提取的完整无缺。通过方法对接头连接效率的分析可以看
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出基因特异性引物( 的’引物)和引物的产物同利用两个基因特异
性引物( 的’和’引物)所扩增的产物强度相近,说明接头连接效率较高。
所建文库共检出阳性克隆个,扩增片段在~ 间,与预期结果一致,
阳性检出率高达%。
结论:我们利用抑制消减杂交技术成功地构建了再障患者骨髓细胞的消减
文库,为后续实验打下了基础,减少了进一步筛选、克隆再障患者骨髓+细胞特异
表达基因的盲目性,提高了特异性。
关键词:再生障碍性贫血; + 细胞;抑制消减杂交

第三部分
差异表达基因克隆序列的测定及同源性分析

目的:对所建再障患者骨髓细胞的消减文库进行序列测定,并对测序结果
进行同源性分析,以了解这些克隆所代表的基因及其可能的功能,以便对它们进行有
的放矢的研究。
方法:我们根据第二部分鉴定结果,选择了插入片段大小不同的个克隆进行
序列全自动分析。所用测序引物为多克隆位点上游通用引物序列
即。通过互联网进入
选择合适参数,实现在线序列的同源性
分析。
结果:在所测序的个克隆中,发现个差异表达的克隆代表了个已知基因(其
中个为重复检出基因)。它们分别是:①
()②
()③
④⑤
⑥()
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⑦⑧
。
结论:用软件对所测定的序列与公共数据库(
)作序列同源性比较,发现多种基因参与了再障患者骨髓+ 细胞的
功能调节。所获得的基因包括了与细胞蛋白合成、生物氧化、信号转导、增殖调控、
细胞迁移有关的基因以及功能尚未明确的基因,这些基因在再障免疫