斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后差异表达基因鉴定及功能研究.pdf

斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后差异表达
基因的鉴定及功能研究





重庆大学博士学位论文


学生姓名:陈环
指导教师:王中康教授
专业:植物学
学科门类:理学




重庆大学生物工程学院
二 O 一三年十一月
Identification and Analysis of Genes
Differentially Expressed in Spodoptera litura
in Response to Nomuraea rileyi



A Thesis Submitted to Chongqing University
in Partial Fulfillment of the Requirement for the
Doctor’s Degree of Science
By
Huan Chen




Supervised by Prof. Zhongkang Wang
Specialty: Botany



Shool of Life Science of
Chongqing University, Chongqing, China
November, 2013
中文摘要

摘要

我国是世界上最大的蔬菜生产国家和消费国家,保障蔬菜稳定生产和供应任
务艰巨,而蔬菜病虫害的发生是导致蔬菜减产的一个主要原因。在我国,每年因
斜纹夜蛾病虫害的发生导致蔬菜生产损失巨大。目前对斜纹夜蛾的防治主要依赖
于化学农药,化学农药的长期施用不仅加深了对环境的污染,而且增加了斜纹夜
蛾的抗药性,由此导致对斜纹夜蛾的防治越来越困难。莱氏野村菌作为斜纹夜蛾
重要的一类昆虫病原真菌,能够有效防治斜纹夜蛾病虫害的发生并不会导致昆虫
抗药性的产生。加强对斜纹夜蛾和莱氏野村菌相互作用机制的研究有利于高效杀
虫靶标的筛选和优化农药杀虫策略。
本研究以莱氏野村菌 CQNr129 和斜纹夜蛾为研究材料,利用消减杂交技术筛
选正常和感染莱氏野村菌的斜纹夜蛾脂肪体中差异表达基因。对差异表达基因硫
氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, SlTpx)和半胱氨酸蛋白酶(Cysteine
proteinases,SlCyP)进行克隆,表达,定位和功能分析,深入研究 SlTpx 和 SlCyp
在防御莱氏野村菌侵染过程中的机理,为后续斜纹夜蛾免疫防卫的分子水平研究
和昆虫与病原微生物相互作用的机理研究奠定基础,同时也为寻找更多有效的杀
虫靶标、开发高毒杀虫莱氏野村菌菌株和设计杀虫策略提供理论依据。
本研究主要研究结果和结论如下:
①斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后差减文库的建立
1) 借助差减杂交技术分离了感染莱氏野村菌的斜纹夜蛾脂肪体差异表达基因。
结合斑点杂交我们从 1175 个单克隆中筛选出了 345 个阳性克隆,经过测序和拼接
最终得到 117 条特异表达的基因序列。通过 BLAST 数据库,GO 数据库以及相关文
献确定了 117 条 Unigene 潜在的生物学功能,根据他们所行使的生物学功能的不同,
将它们分为 7 大类。在这 117 条序列中,有 74 条在非冗余蛋白序列数据库中找到
同源序列,参与了不同的生物学过程,其余 43 条序列被归类到未知功能一类。在
找到的 117 条 Unigene 中只有 2 条在斜纹夜蛾物种中有相关文献进行了研究报道,
而其余 115 条通过 BLASTn 没有找到在斜纹夜蛾物种中与其相似序列,这说明这
115 条序列是在斜纹夜蛾中首次发现。
2) 通过半定量分析,随机筛选的 7 个基因在斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后的脂
肪体中有较高水平表达。通过实时荧光定量分析,Hsp70 基因、 Hsp90 基因、
gallerimycin 抗真菌肽基因和半胱氨酸蛋白酶基因表达在斜纹夜蛾机体内被莱氏野
村菌侵染后都显著上调。
本研究建立了斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后脂肪体差减文库,筛选鉴定了 117
I
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条差异表达基因,其中 115 条基因在斜纹夜蛾中首次发现。进一步研究分析表明
这些基因参与了斜纹夜蛾不同生物学功能并能被莱氏野村菌侵染后显著上调表达,
本研究为斜纹夜蛾免疫防卫的分子水平研究和斜纹夜蛾与莱氏野村菌相互作用的
机理研究奠定基础。
②斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶基因的功能研究
1) 斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶 cDNA 全长 1165bp 序列,翻译 195 个氨基
酸。多序列比对