基因工程大作业.docx

基因工程大作业.docx川萼甜菜碱醛脱氢酶基因
的真核表达载体构建
姓名：陈艳红
学号： 20104491
班级：生工3班
目录
前言 3
一 宿主 4
二：表达载体 4
载体选择 4
载体背景介绍 4
PBI121载体图谱 5
PBI121相关位点图谱 6
载体在NCBI中的信息 -6
目的基因 9
背景资料 9
研究目的 10
基因序列 10
酶切位点 15
酶切位点的选择 15
酶切位点的说明 15
引物设计与合成 16
引物设计说明 16
引物设计 17
引物评价 18
加入酶切位点 19
过程 19
目的基因的获得 19
目的基因的PCR扩增 20
载体的制备 20
构建重组质粒 21
转化子鉴定 21
受体材料的准备与预培养 22
根癌农杆菌培养 22
侵染 22
共培养 22
选择培养 22
继代选择培养 22
生木艮培养 23
、八、・
刖B
本次的真核表达载体构建选择川与甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH) 作为目的基因，主要是基于我有幸参加了西南交通大学第七期SRTP 项目《川萼的甜菜碱醛脱氢酶基因的真核表达载体的构建及表达研 究》。在准备项目的过程中，阅读了大量有关川与甜菜碱醛脱氢酶基 因(BADH), PBI121载体以及真核表达载体构建的文献，故对相关知 识已经有所了解和掌握。
由于甜菜碱能够提高植物对胁迫的耐受性，且其合成途径比较简 单，遗传操作比较方便，因此甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的 胁迫抗性基因之一。迄今为止，已有不少植物被成功地导入了 BADH基 因，并在不同程度上提高了植物的抗逆性。本研究希望获得川与BADH 基因，利用川与BADH基因的开放阅读框与组成型启动子CaMV35S融 合的重组表达载体，构建植物表达载体，利用根癌农杆菌介导转化烟 草，获得转基因烟草，并研究该基因的功能，探讨川苓BADH基因与 其抗逆性之间的关系，具有较大的实际应用价值。
在此次构建真核表达载体的过程中，先后遇到了不同的问题。比 如引物设计、重组质粒的构建及转化等。在此，我要感谢《基因工程》 课程老师郭泰林老师以及SRTP项目指导老师周嘉裕老师的悉心指导。 同时，本说明书中依然存在很多不足与错误的地方，敬请郭老师斧正。
宿主：烟草
烟草是常用的植物宿主。主要具有两大优点：
植物基因序列清楚。
遗传转化体系完善。
表达载体
载体选择：选择PBI121作为载体
载体背景介绍：
载体类型：植物表达载体。
细菌抗性：卡那霉素(Kanamycin)。
测序引物:NOS promotor, NOS terminator。
载体简介：载体pBI121是一个常用的植物表达载体,CaMV35S 启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTI为卡那霉素抗性选择标记 基因，以。一葡萄糖昔酶(p—glucuronidase,Gus)为报告基因，经 PBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的 特性，经组织化学染色呈蓝色。
图1 PBI121载体图谱
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pBI121 m
KHGAGGHK仰浙GGIUWHIIAIG
FT Tjh Horn aontech
AD0I 叩时 catalogue 1996/97
图2PBI121相关位点图谱
启动子：35S
终止子：Nos
报告基因：GUS
抗性基因：Nptll
pBI121 在 NCBI 的登陆号：AF485783
以下是在NCBI中搜索的关于PBI121载体的位点信息：
4 NCBI
Display
Limits Preview/lndex History Clipboard Details
GenBank | 5 ▼ Send to ▼
Links
circular SYN 15-MAY-2003
1: AF485783. Reports Binary vector
pBI... [gi:19569229]
LOCUS AF485783 14758 bp DNA
DEFINITION Binary vector pBI121, complete sequence.
ACCESSION AF485783
VERSION AF485783. 1 GI:19569229
KEYWORDS
SOURCE Binary vector pBI121
ORGANISM Binary vector pBI121
other sequences; artificial sequences