传染病-实习报告.doc

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传染病-实习报告
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实验准备
（一）灭菌消毒用品：手术刀片、手术刀柄、剪刀、大镊子、小镊子、剪刀、
黄色枪头一盒、用锡箔纸包好小滤器、玻璃匀浆器、、PCR管。
（二）其他用品：解剖盘、酒精灯、酒精棉球、解剖刀、记号笔、注射器、染色缸、乳胶手套、接种环、载玻片、细菌涂布棒、倒置显微镜等。
（三）试剂及配制
（6块以上）成分：
TSA：8g 琼脂粉：
去离子水 200mL
121℃， 15-20min， 冷却至50℃左右， 加入5mL的小牛血清，
（10管）成分：
TSB：
去离子水：50ml
混匀后可分装小试管内（每管3mL） 121℃，15-20min
用之前每只试管加1μL血清，1μLNAD
血清：用前要灭能（56℃， 40min）
： NaCI 加入50mL去离子水，然后高压灭菌
：在50ml的DMEM液中加入1ml的血清和1ml的双抗（青、 链霉素）(研究生配制）；
（一起配置）：
10*TE buffer (100ml)
1M Tris-HCl buffer （PH=8） 10ml
500mM EDTA(PH=8) 2ml
定容至100ml，高压保存
‚1M Tris-HCl （PH=8）（100ml）
Tris至80ml去离子水，，定容至100ml，高压灭菌
ƒ500mM EDTA（PH=8）
Na2EDTA•H2O至80ml去离子水，加2gNaOH，定容至100ml
（四） 倒TSA平板
将TSA溶液高压后冷却至60℃左右，加入小牛血清和NAD。然后将平板边沿用酒精灯外焰灼烧消毒，将TSA溶液倒入平板中，均匀铺满整个平板，待其冷却凝固后，标记好班级，组名和时间等备用。
日期： 星期：星期二
细菌学检查和病毒学检查病料取样。
1． 细菌的分离培养：
取病猪肺脏（冰冻组织需充分解冻），用酒精棉球点燃消毒肺脏表面，无菌手术刀切口，将接种环伸入于肺脏肺泡内，无菌划线接种TSA平板。具体操作如下：
a) 右手执笔式持接种环，在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷；
b) 左手抓紧琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。或者，将平皿盖放在试验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰；
c) 右手接种环在琼脂的一端涂布，划线时，接种环与琼脂表面是30°-40°的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面；
d) 接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明接种时间，接种者等，然后将平皿的底朝上，放置在37°温箱内培养24-48小时（培养后可出现多种菌落，注意区分不同培养时间点不同类型菌类形态）。
2．组织触片和染色观察：
a) 触片：取一小块肺脏组织，在洁净的载玻片上轻轻地作2～3 个压迹，制成触片；
b) 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形；
c) 固定：在酒精灯处快速的来回通过2-3秒钟，并不时以载玻片背面接触皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色；
d) 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min；
e) 水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；
f) 媒染：用100-1000μL移液枪吸取约300μL碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min；
g) 水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；
h) 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗；
i) 复染：滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖触片约1min；
j) 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止；
k) 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观