博士论文-透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质酸分子量调控机制的初步研究.pdf

山东大学
博士学位论文
透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质
酸分子量调控机制的初步研究
姓名：生举正
申请学位级别：博士
专业：微生物与生化药学
指导教师：凌沛学;王凤山
20090520
的合成途径中，包括透明质酸合酶、咸烟墙沽姿峄，是合成途径中的关键酶，具有利用的催化活性。黄咸烟峭亚饷一葡萄糖焦磷酸化酶和乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶是参与底物合成的酶类，通达载体籹蚿．将兽疫链球菌来源的合。同时，通过融合椒ǖ玫揭桓鲋刈镠铣刹僮葑樱猺，在该现校抟吡辞蚓鶫铣刹僮葑又械膕蛃虻直鸨蝗樗崛榍蚓丛吹膗和以基因的所取代。重组合成操纵子ü刈楸泶镌靥錺．既肴樗崛榍蚓鶱校得到工程菌株。ú舛ǜ鞴こ叹暧盏己蠓⒔鸵褐蠬呐ǘ取？乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶基因訡编码。体钠鲐崞舳拥骺刂拢玫胶衟来源复制起始位点的表化在乳酸乳球菌工程菌株中成功实现内源或外源蛋白可控表达的先例。这些特点达，从而在不同诱导条件下改变兽疫链球菌險．葡萄糖脱氢酶之间表达水平比率，为微生物合成分子量调控机制的研究提供了可能。在细胞内的合成是一个复杂的过程，有多种酶共同参与。在兽疫链球菌达载体畇．和畇＝ê兄柿成操纵子分别导入乳酸乳球菌和，得到工程菌株和有助于在本论文中实现乳酸乳球菌工程菌株中和基因的可控表、黄咸烟峭亚饷⒘姿崞咸烟且旃姑浮被R泼浮乙酰基转移酶、变位酶和乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶。其中透明质酸合酶葡萄糖醛酸．和乙酰．被咸瓽合成过一系列催化反应，分别将葡萄糖转化为瓽和狦，Ｔ谌樗崛榍蚓校泊嬖谧庞雜蛃同催化活性的咸烟峭亚饷瓽蚒阴０被咸墙沽酸化酶，分别由乳酸乳球菌咸烟峭亚饷富和本论文分别将基因、和的刈橛贜泶镌一和的乳酸乳球菌工程菌株分别命名为瓵、瓸和瓹。通过重组表白对照菌株和分别单独表达、的工程菌株一山东大学博士学位论文一、
的相对分子质量一般分布在疞的。证明乳酸乳球菌本身不具有合成的能力，而在该菌中单独表达梢允构こ叹昊竦煤铣蒆哪芰Γ腋镁旧砭哂蠬疞，前者大约高出后者％。证明在乳酸乳球菌工程菌株中重组表达异源的能力。而目前微生物发酵生产的是从大到小的一系列糖链的组合。因此，在活体微生物中确定的调控机制并且建立制备特定或特定范围分布的的方法，不但具用价值。体外实验己证明，合成能力与底物浓度的比率是影响的主要因株中合成能力与底物浓度的比率的可控调节，本论文构建了一个双质粒的调畇饬礁鲋柿？晒泊嬗谕恢耆樗崛榍蚓小一受到肠积启动子的调控。蛋白表达结果证明在工程菌株中，借助．姆⒔鸵褐忻挥屑觳獾紿暮铣桑こ叹闚瓵发酵液中含有物瓽蚒．的合成途径。工程菌株的发酵液中含有疞的，这一数据约为．⒔鸵褐蠬ǘ鹊．叮庖唤峁证明虽然乳酸乳球菌具有合成瓽蚒—的能力，但自身合成的底物的不足限制诠こ叹曛泻铣筛吲ǘ鹊腍岣吖こ叹底物的浓度，有助于合成能力的提高。工程菌株和发酵液中的浓度分别为疞和，同时超表达同源瓽和较同时表达外源、和更利于的合成。本论文利用基因作为食品级筛选标记和表达系统，构建得到一株不产生荚膜的具有食品级合成能力的工程菌株，而食品级在保健食品、医药产品和化妆品的应用中具有明显的优势。范围内。研究表明，在细胞和组织中，生物活性与糖链长度相关，不同的具有不同甚至相反的生理或药理作用，的多种生物活性具有依赖性。通过差异表达合成相关酶类，脊椎动物具有在体内调控有重要的理论意义，而且对扩展的应用范围、改良含产品的质量具有应素之一，我们认为这一理论同样适用于活体微生物内。为实现乳酸乳球菌工程菌控表达系统，包括表达的载体畇捅泶飐脑靥包含有乳酸乳球菌常用载体母粗破鹗嘉坏悖鴖蛭挥贜系统启动子的调控之下；而另一个载体畇蚝辛硪桓鋈樗乳球菌常用载体母粗破鹗嘉坏悖眘虻挠盏急泶山东大学博士学位论文～
工程菌株合成的重均分子量的影响，在微生物体内证明液中的肺相对较小，而当／比率减小时，硫则变一个肿幽芄缓铣傻腍橇淳拖喽越隙蹋佣斐珊铣傻腍睦染来合成糖链，从而造成合成的的糖链较长，胁也变大。这一理论的确了合成能力与底物合成能力之间的相对强弱具有调控厕的作用。当代畇蚿．组成的双质粒调控表达系统，实现了不同拷贝数之间的比率，表征着合成能力与底物合成能力之间的相对强弱。不同诱导条件下，分析／表蚒．湎喽郧慷鹊膕痵大。分析认为，合成能力与合成底物能力之间的相对强弱是影响微生物细胞体内每一个肿幽芄环峙涞降挠美春铣蒆牡孜锞拖喽越仙伲蛎较小；而当这一比率降低时，每一个肿泳陀邢喽越隙嗟牡孜锓肿涌梢杂特性提供了切实可行的解决方案，具有重大的理论意义和潜本论文的主要内容