荧光标记蛋白发展.ppt

LOGO 荧光标记蛋白的发展华中农业大学工商管理 0901 李佳佳 Saturday, February 18, 2017 荧光标记蛋白技术实际上是也是一种标记技术。就如同最早用 P标记脱氧核糖核酸用 S标记蛋白质是一样。左图所示为验证 DNA 和蛋白质谁是遗传物质的实验 Saturday, February 18, 2017 荧光标记蛋白在生物研究反面的作用荧光标记蛋白的基因可作为报告基因提供细胞内物质的跟踪定位如图所示为肽链的形成过程肽链经过弯曲、折叠、多条肽链的重叠等形成蛋白质。所以,如若一开始便把荧光标记蛋白的基因插入到某一特定基因内, 则新的基因会合成荧光融合蛋白 Saturday, February 18, 2017 如左图所示,当体内物质融合了荧光蛋白后会发出荧光,用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可以看见,若在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。例如,要研究细胞内某蛋白质的游走状态,则用荧光蛋白标记后, 其所处位置清晰可见。 Saturday, February 18, 2017 ①最早为水母体中提取的 GFP ②在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光的第二类荧光蛋白 FHP 及其典例 GPAC ③最新的 PRIME 技术技术变革 Saturday, February 18, 2017 GFP 1, GFP 的发现 GFP 是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质—— aequorin ,它本身发蓝光。 GFP 能把这种光转变成绿色,也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。受到 Ca2+ 或紫外线激活时, 水母中的发光蛋白 Aequorin 被激活, 产生蓝光, GFP 能够吸收蓝光( 395nm 处有最大光吸收) , 发射绿色( 或黄绿色) 荧光 Saturday, February 18, 2017 2, GFP 发光原理 GFP 控制光的部位是其自身的一部分, 仅由氨基酸构建而成,该部位含有一段三个氨基酸组成的特殊序列:丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸(有时丝氨酸会被相似的苏氨酸取代)。当蛋白质链折叠时,这段短片段就被深埋在蛋白质内部,然后,发生一系列化学反应: 甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键,生成一个新的闭合环,随后这个环会自动脱水。最终,经过大约一个小时的反应,周围环境中的的氧气攻击酪氨酸的一个化学键,形成一个新的双键并合成荧光发色团。蛋白质链形成一个圆柱形罐头(蓝色),子链的一部分直接从中间穿过(绿色),发色团刚好在罐头盒的中间,它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。 Saturday, February 18, 2017 3,与其他报告基因不同的性质①从生化角度来讲, 所有已知的荧光素酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底物, 使产物分子处于一种激发态而发光。这种酶/底物的相互作用是生物发光的普遍模式。而 GFP 是第一个例外, 它的 27kDa 的单体由 238 个氨基酸构成, 本身就是一个生物发光系统。其荧光机制是自身含有的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子② GFP 的表达无种属特异性。不管细胞的种类和位置如何, 都能够自主表达; ③ GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等不利因素[1] 。 GFP 的荧光可以耐受福尔马林的固定, 因而可以制成长期保存的标本; ④对细胞内 GFP 的检测非常简单, 用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可实现 4, GFP 目前存在的不足( 1) 检测灵敏度还有待提高, 而且其荧光信号强度方面的非线性性质使得定量非常困难。( 2) 新生 GFP 折叠和加工成为具有荧光活性形式的过程十分缓慢, 使得某些快速过程如转录的激活过程还难以用该方法进行研究。( 3) 紫外激发对某些 GFP 有光漂白和光破坏作用, 导致荧光信号快速丧失。( 4) 多数生物具有微弱的自发荧光现象, 并有着类似的激发和发射波长, 这些荧光背景会影响某些 GFP 的检测。 Saturday, February 18, 2017 FHP ( fluorescent highlighter proteins 光激活蛋白即第二类荧光蛋白) 及 GPAC ( Green _ photoactivatable _ Cherry 光激活绿樱桃) 1,第二类荧光蛋白, FHP ①特点这些荧光蛋白在适当的刺激下会经历结构的改变,从而打开荧光这个开关,或者荧光发射波长改变。与第一代荧光蛋白相比,它们的优势在于能脉冲标记细胞或分子亚群,从而实现复杂的动力学时空分析②典例: PAGFP , mRFP1 , KFP1 , Dronpa 等③缺点:其中一些蛋白光转换效率不高,亮度