肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究.pdf

河北医科大学
博士学位论文
肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究
姓名:王晓娟
申请学位级别:博士
专业:神经病学
指导教师:李春岩
20040401
肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究铜,锌超氧化物歧化酶的基因突变,提示可能就是一种基因病,而病因学研究发现サ腇约占总的颊叩.%激活及突触间隙中的谷氨酸过多堆积均可通过激活谷氨酸受体对突触后谷氨酸转运体,尤其是星形胶质细胞上的高黏附性的谷氨酸转运体,可以转运细胞外的谷氨酸,这是机体避免兴奋毒的主要机制。当谷氨酸转运体要随意运动的上下运动神经元选择性受累的神经系统变性疾病。它是以进行性的肌肉无力为特点的致死性疾病,患者多在首次出现症状后的昴患病率多在颍/万,是成年人最常见的导致瘫痪的疾病之一。根据其特点本病又可分为家族型肌萎缩侧索硬化現和散发型肌萎缩侧索硬化琒,其中不足%,而则占整体的%以上。牡湫筒±砀谋湮Fげ闵显硕窬:湍愿伞⒓顾璧经元通常也发生萎缩,在胞体和轴突中有神经丝的异常聚集。时至今日,治疗上除仅有的几种缁低ㄆ⒘θ缣能在一定程度上延长的病程外,尚无特效的治疗手段,这主要是由于人们对此病运动神经元损的发病机理可能集中在以下几个方面:兴奋毒作用、自身免疫异常、氧化谷氨酸是中枢神经系统内最主要的兴奋性递质,谷氨酸能神经元过度神经元及其周围组织造成兴奋毒性。在胶质细胞和神经元胞体中均存在有功能受到明显抑制时,就会造成细胞外谷氨酸堆积形成兴奋毒性。脊髓的器官型培养可以长时间地进行培养并可维持相对完整的脊髓摘肌萎缩侧索硬化珹且恢种死于呼吸衰竭。该病的平均发病年龄在岁,发病率在蛞/万,下运动神经元丧失,锥体束变性,以脊髓的改变最为明显,残留的运动神伤的原因、机制及转归等了解不清所致。实验模型的建立将有助于人们进一步探讨其发病机制,开发新型神经保护治疗。占蠖嗍腟∪说牟∫蚰壳叭圆磺宄R恍┭芯肯允維应激、神经元调亡及线粒体功能障碍等。其中以兴奋毒机制证据最多。中文摘要
结合谷氨酸兴奋毒机制,慢性阻抑培养脊髓片的谷氨酸转运,可以制备奶逋馀嘌P汀5谌糠掷锰逋馀嘌P凸鄄霢患者血清对和背角中间神经元进行鉴别,建立稳定的脊髓体外培养模型。观察体外大态和恒定的腹角硕窬J浚⒛苣D馓迥谏せ肪车奈榷ǖ奶外脊髓器官型培养模型。用组织切片机切成厚的薄片,将腰段脊髓的切片转移到上放隒培养箱妫%%空气恐芑灰次。长的脊髓做比较,用抗单克隆抗体对脊髓片背角的中间神经元腹角均有个左右的硕窬1蝗境缮钭厣ǎ渲本毒时期的大鼠比较无显著差异。组化染色见双侧脊髓背角有大量阳性着色的中、小体积的中间神经元,而脊髓腹角硕窬形态,较单细胞培养更适于研究脊髓病变。我们利用脊髓器官型培养技术,课题研究分三部分:第一部分建立脊髓片器官型培养方法,并将培养的脊髓片与体内发育至同时期的脊髓做比较;第二部分依据谷氨酸兴奋毒机制,,使细胞外谷氨酸堆积对运动神经元造成损伤而感觉神经元不受影响,建立一、脊髓薄片器官型培养的方法研究目的:研究脊髓薄片器官型培养的方法并对脊髓腹角Ⅱ运动神经元鼠器官型培养的脊髓薄片是否与同龄大鼠体内生长的脊髓具有相似的形方法:脊髓器官型培养采用樟銼笫蟮难渭顾瑁谖蘧跫下快速分离、取出整条脊髓,解剖显微镜下分离并剪断腰段脊髓的神经根,中,在室温下仔细分离成单片,着嘌迥诿靠追湃雔培养基.,将完好的脊髓片转移至上,每个测定各时点培养液中乳酸脱氢酶暮俊S蒙窬5奶匾煨悦庖组化染色对脊髓腹角Ⅱ运动神经元加以鉴定并与同龄大鼠体内生结果:脊髓片在体外生长良好,形态完整,培养存活率高,达%以上;存活时间长,,突起细长,彼此形成突触联系,Ⅱ运动神经元数目与体内发育至同奶逋馀嘌P停徊教教盅≡裥栽硕窬K鹕说牟糠只啤脊髓运动神经元的影响,探讨其选择性运动神经元损伤的部分机制。,并放置进行鉴别。中文摘要
酶染色观察线粒体功能,用透射电镜观察神经损伤的超微结构变化并测定结论:本实验研究成功地建立了大鼠腰段脊髓的器官型培养模型,并能以免疫组化方法对腹角硕窬:捅辰歉芯跎窬=屑稹E嘌别,在一定时期内可以模仿体内的生存环境,为研究脊髓生理、病理改变二、肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的研究体快速清除,特别是星形胶质细胞上存在有高效的谷氨酸转运体,对于维持细胞外谷氨酸的浓度于正常范围、避免兴奋毒性具有重要意义。当谷氨展引起谷氨酸堆积就会诱发兴奋毒性。此部分研究的目的在于应用脊髓片器官型培养模型,,制备选择性运动神经元死亡的逋馀嘌P汀方法:取出生后烊槭蟮难渭顾枳橹衅黾顾杵鞴傩团嘌养旌螅谂嘌褐蟹直鸺尤氩煌ǘ萒疞、/同时点脊髓腹角硕窬<氨辰侵屑渖窬=屑鞘苗晁嵬亚各时点培养液