实验计划书样本.doc

实验计划书样本.doc实验计划书
实验计划书
（初定）
XXX
年XX月XX号
此为初步计划书，还有很多不成熟甚至错误之处，望老师给予指出!
I总体计划
本实验总体上分为三大步。(1)生理实验部分:本部分主要进行 papaya硬度和细胞壁相关酶类活性的测定。(2)分子实验部分:本部 分主要是获得papaya细胞壁相关酶类的基因序列以及由RNA差异表 达谱获得细胞壁代谢酶基因等的表达特征。(3)验证实验部分:本部 分主要通过实时荧光定量PCR的方法(Real time Q-PCR)验证并初步 确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。
生理实验部分是第一步需要实施的，也是比较独立的部分，初步 定为40天左右的时间结束。分子实验和验证实验部分是本实验的核 心，这两部分紧密结合，需要同步进行，首先是各种样本(CK, ETH, 1-MCP)的获得，随后是各样本的RNA提取，然后委托深圳华大基因公 司进行转录组测序并从转录组中筛选细胞壁代谢相关的基因序列，采 用5RACE及3RACE的方法，获得这些基因的全长序列以及构建差异表 达谱进行相关差异基因筛选等生物信息分析，最后通过实时荧光定量 PCR的方法(Real time Q-PCR)验证并初步确定与"橡皮化”相关的
细胞壁代谢酶基因的家族成员。
II详细计划
一，买果。
二，采后预处理：
采后立即运回实验室，剔除病果和机械损伤果，选用形状、大小、 外观颜色相对一致的番木瓜果实，。g/L的次氯酸钠溶液洗果10 min,,取出晾干后备用。
三，样品分组（四组）：
:果实用PE （聚乙烯）保鲜袋包装，轻绑袋口，置于低温（15°C） 的恒温箱中贮藏。
（橡皮化果实）：在室温条件下（25°C）,,取出果实后用PE保鲜 袋包装，轻绑袋口，置于15°C （冷藏）、RH （相对湿度）为90%的条 件下贮藏。
g/L的乙烯利处理:在室温条件下（25°C）, g/L的乙烯利处理 果实3分钟，取出果实后用PE保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15°C （冷 藏）、RH为90%的条件下贮藏。
四，实验过程：
贮藏过程中每隔2d （催熟果实）和5d取样一次，鲜果或-70°C 贮存，为以后进行基因表达水平的研究。
取样的同时，进行以下生理指标的测定：
使用果实硬度计（FHM-1型，日本产）进行测定。
（多聚半乳糖醛酸酶）活性：
称取lg果肉，加入5mL（先力口3mL,后用2mL冲洗），（含5% mM 的EDTA （乙二胺四乙酸）），冰浴研磨匀浆。然后在10000转离心 30min,将上清液进行透析,，，透析液不含EDTA和NaCL透析条 件：4°C条件下放24小时，中间换一次缓析液，透析完的溶液用于酶活 力的测定。该操作在冰浴下进行。
PG活性测定:PG活性测定以1%多聚半乳糖醛酸（PGA ,美 国Sigma公司）为底物，反应混合液为:1% mL、醋酸钠缓冲液 （pH）mL、mL, mL的水（总反应体系为3mL）,40 °C反应60 min, 立即加入ImLDNS （3, 5-二硝基水杨酸）终止反应。再加入沸水中煮沸 10 min后冷却，于波长540 nm下定量分析酶水解生成的半乳糖醛 酸含量。以3mL蒸馄水+1 mLDNS作为对照（CK）。以每小时释放 lmg的D-半乳糖醛酸（美国Sigma公司）为1个酶活性单位（U）。 以标准D-半乳糖醛酸绘制标准曲线。试验重复3次。对照不加酶液, 以缓冲液代替。
（果胶甲酯酶）酶活性：
取2g果肉，加3mL预冷的1 mol/L NaCl和2 g PVP （聚乙烯 基毗咯烷酮）置于研钵中，充分研磨后，转移到离心管中，再用2mL NaCl
润洗，倒入离心管中，于冰浴中放置1小时，每隔20 min震荡 一次，在4°C下，10000转离心30 min,收集上清液，mol/L,于4°C 保存备用。测定：% （w/v）的果胶放冰箱备用’有效期5天、％漠麝香酚兰指 示剂棕色瓶（），mL水，mL酶液（酶液最后加入），mL。立即将试 管放入37°C的水浴锅中30 min,以蒸憎水为CK。取出试管后冷却, 迅速测定其在620 nm波长一分钟内的变化。（U）,以U/。
（CX）:
mol/L （）的醋酸钠缓冲液中，，放低温下溶解，定容至100 mLo
酶液的制备同PGo
活性测定:反应体系为1 mLCMC （竣甲基纤维素钠）溶液，酶 液1 mL,醋酸钠缓冲液（pH ） mL （总反应体系为3mL） ,40 °C保温 60 min,取出加入3, 5 —二硝基水杨酸（DNS） 1 mL终止反应；加 入沸水