生物制药工程生物制药工程主讲教师: 刘凯 liukai_1982@ 山东农业大学生命科学学院微生物系第六章基因工程制药工艺? 基因工程制药微生物表达系统? 基因工程大肠杆菌的构建? 基因工程菌的发酵培养与控制基因工程技术—基因重组示意图? DNA 片段经酶切、连接,形成重组 DNA 分子?导入宿主细胞系统中扩增?目标基因表达, 生成新产物, 出现新性状 基因工程大肠杆菌的构建技术? 构建流程? 目标基因的克隆? 表达载体构建? 工程菌构建 工程菌构建流程目标基因克隆 PCR 、文库,化学合成表达载体构建酶切、连接遗传转化与筛选外源基因导入与培养工程菌新性状、功能、物质工作内容方法 目标基因的克隆策略?目标基因: 编码蛋白质或多肽的 DNA 序列?正确克隆的重要性: 只要有一个碱基发生(错义、无义、移码)突变,就导致编码氨基酸的变化,影响产物蛋白质的功能和生物学活性。只要一个碱基发生同义突变,就可能导致生产过程和效率变化。基因克隆方法的选择受合成仪器性能限制,长度很短简便,准确,已知序列,引物合成化学合成繁琐,过程复杂, 耗时,昂贵长片段,无碱基错误,未知序列基因克隆文库筛选 DNA 聚合酶活性和保真性限制简便快速,高效, 数kb ,单基因克隆 PCR 扩增缺点优点方法 PCR 技术? PCR ( Polymerase chain reaction ,聚合酶链式反应):由 DNA 聚合酶催化下,对特定 DNA 序列进行的复制反应。?本质:生物体的 DNA 复制原理在体外合成基因。?发明者: Mullis ,生物技术革命性象征, 1993 年获得诺贝尔化学奖。?在引物指导下,以 DNA 为模板,由 DNA 聚合酶催化的扩增特定 DNA 序列聚合延伸形成互补序列的反应。 3’ AGCGAGGCATCG 5’ 5’ TCGCTC CGTAGC 3’ PCR 单反应原理与过程(1) 变性( 94 ℃) (2) 退火( 55 ℃) (4) 完成一个循环(3) 延伸( 72 ℃)
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