可溶性糖测定.doc

实验1 可溶性糖的测定
一、实验目的
1．学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。
2．学习721型分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理
总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。
其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糖醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。溶液含糖量在150μg /ml以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接作用，样品不必经过水解。
三、实验器材
1．试管（或具塞试管） 2. 吸量管及试管架（1 ml、10 ml）3．沸水浴4. 冰浴
5．721型分光光度计
6．蒽酮试剂
称取100 mg蒽酮溶于100 ml 98%硫酸溶液（）中，用时配制。
7．葡萄糖标准溶液（100 μg/ml） 200 ml
精确称取100 mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000 ml。
8．样品溶液 200 ml 可自选待测物制成样品溶液。
举例：称取500 g市售白薯（或淀粉），洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层纱布压滤、弃滤液溜渣，将渣放于烘箱内80～85℃烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取100目筛下物为待测样品。
取样品在烘箱内105℃烘干，恒重后，精确称取1～5 g，置于锥形瓶中，加入80 ml沸蒸馏水，放入沸水浴。不时摇动， h。取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。冷却至室温，用蒸馏水定容至100 ml。
9．白薯。
四、实验步骤：
1．制作标准曲线 取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。
编号
试剂(ml)
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液（100μg/ml）
H2O
蒽酮试剂
0

10


10


10


10


10


10


10
每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂 要在冰浴条件下加入蒽酮，以防止发热，影响颜色反应。生成的颜色较稳定，在4 h内无明显变化。
后，同时置于沸水浴中，准确加热7 min，立即取出置冰浴中迅速冷却。待各管溶液达室温后，用1 cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。然后以第2～7管溶液含糖量μg为横坐标，吸光度（OD620）为纵坐标，画出含糖量与OD620值的相关标准曲线。
2．测定样品的含糖量 取4支试管按下表操作。
编号
试剂（ml）
1
2
3
4
样品溶液
H2O
蒽酮试剂
0



0


0


0

其他操作与制作标准曲线相同。将第2～4管测出的OD620平均值，根据OD620平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，再换算成100 g样品中总糖的含量。
五、思考题：
用蒽酮比色法测定样品中糖含量时，应注意什么？为什么？
实验2 氨基酸的总量测定和纸层析分离鉴定
Ⅰ 甲醛滴定法测定氨基氮
一、实验目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、实验原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定—NH3+所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色减小于10，很难准确指示终点。
常温下，甲配合能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使—NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量 脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定ml数偏低。酪氨酸的滴定ml数偏高。
。如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。
三、实验器材
25 ml锥形瓶，3 ml微量滴定管，吸管。
mol/L标准甘氨酸溶液： mg甘氨酸，溶解后定容至100 ml。
mol/L标准氢氧化钠溶液 标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
酚酞指示剂：%酚酞的50%乙醇