DNA琼脂糖凝胶电泳分析.ppt

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
同组人员：黄梦秋 张如骐 肖重科
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DNA琼脂糖凝胶电泳分析
实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
实验原理
DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。
在 pH 值为 ～ 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
实验器材和试剂
实验器材：
桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪
样品： DNA分子量标准品，质粒
试剂
琼脂糖
1×电泳缓冲液（TBE）
6×上样缓冲液
溴化乙锭(EB) ：10mg/ml
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
上样缓冲液
％溴酚兰；％二甲苯青；30％甘油水溶液
作用：
①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内
②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置
③使样品呈色，使加样操作更方便
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
琼脂糖凝胶
天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉
从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
琼脂糖（agarose）
琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。
琼脂
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
电泳指示剂：
核酸电泳常用的指示剂有两种
溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）；
二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
核酸电泳的染色剂
最常用的染色剂
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光
，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min
EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。
（注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。 ）
银染色
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
影响琼脂糖凝胶电泳的因素
DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比；
琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；
DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大
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