生物制药课件（十四章）.ppt

第十四章核酸类药物
  第一节核酸类物质的分离提取及其发酵生产
  一、RNA与DNA的提取与制备
(一)RNA的提取与制备
1、工业用RNA的提取
(1)RNA及其工业来源从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源,如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素,制霉菌素等菌体。
通常在细菌中RNA占5%~25%,%~15%,%~28%。
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响,其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高,易于提取RNA。
很显然在许多酵母中,早期细胞中的RNA含量高,其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
(2)高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株,也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。
稀碱法:是用氢氧化钠溶液(1%),使细胞壁变性,使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体,将pH调至RNA的等电点(),使RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA,90 ℃保持3~4h破坏酶)。
浓盐法:是用高浓度盐溶液(6%~8%)处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。
要避免分子降解,可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料,使蛋白质变性,然后离心,上层水溶液内含有全部RNA,可用乙醇沉淀出来。
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,,。
(4)RNA的提取实例:啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母(含水份70%),加入230ml含NaOH 3g的水,20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol/L HCl调至pH7,搅拌15分钟,离心得清液255m1。冷至10℃以下,6mol/L ,置冷过夜,离心得RNA (纯度80%)。
(二)DNA的提取与制备

取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2次成浆状,加入等体积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌,升温至100℃,保温15分钟,迅速冷却至20~25℃,离心除去鱼精蛋白等沉淀物,获得35L含热变性DNA的溶液,经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA,在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95%乙醇,离心可获得纤维状DNA,沉淀用乙醇、丙酮洗涤,减压低温干燥得DNA粗品,产品含热变性DNA50%~60%。
2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏(肝、脾、胸腺)加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟,匀浆于2500r/pm离心30分钟,沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次,每次洗后离心,将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中,再捣碎3分钟,加入2倍量5%的(用45%乙醇作溶剂)十二烷基磺酸钠,并搅拌2~3小时,在0℃2500r/pm离心,在上层液中加入等体积的冷95%乙醇,离心即可得到纤维状DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水,加入5%十二烷基磺酸钠达1/10体积,搅拌1小时,经5000r/pm离心1小时,清液中加入NaCl达1mol/L,再缓慢加入冷95%乙醇,DNA析出,经乙醇、丙酮洗涤,真空干燥得具有生物活性的DNA(活性DNA制备需在0~3℃操作)。
二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸
(一)酶解法及碱水解法制备核苷酸
1、酶解法制备脱氧核苷酸
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶
红酵母产生3`-磷酸二脂酶
2、酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸,日本年产呈味核苷酸(肌苷酸和鸟苷酸)3000吨,其中60%是使用酶解法生产的。
酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程